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菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)属软体动物门、双壳纲、帘形目、帘蛤科、蛤仔属,是我国单种产量最高的养殖贝类,具有重要的经济价值。本研究以高通量测序手段对不同发育时期的菲律宾蛤仔进行转录组分析,并采用荧光定量PCR技术对各个发育时期Hox基因家族进行表达谱分析。研究结果对研究菲律宾蛤仔早期胚胎发育、幼虫变态以及器官形成等过程的分子调控机制提供理论依据。 1、菲律宾蛤仔四个发育时期转录组分析 通过Illumina HiSeq2000测序平台对菲律宾蛤仔四个发育时期(担轮幼虫时期、D形幼虫时期、壳顶幼虫时期、匍匐幼虫时期)进行转录组测序分析,共获得210,409,328条clean reads,共识别注释了27,652个基因。数据分析发现:壳顶幼虫与匍匐幼虫两个时期的比较中得到的差异基因占总差异基因的90%,可能与发育过程中蛤仔生活方式的转变有关。担轮幼虫与D形幼虫两个时期的差异基因主要包括与生物矿化与消化过程有关的基因,如钙调蛋白基因(Calmodulin)和组织蛋白酶基因(Cathepsin)等。本研究结果可为菲律宾蛤仔发育生物学研究提供候选基因,为生物进化的研究提供基础数据。 2、菲律宾不同发育时期及成体不同组织中内参基因筛选 采用内参基因筛选方法geNorm、NormFinder及△Ct对菲律宾蛤仔不同发育时期和成体不同组织中的12个候选内参基因,包括延伸因子1α基因(EF1A)、TATA盒结合蛋白基因(TBP)、组蛋白H3基因(HIS)、细胞色素b5基因(CYTB5)、泛素缀合酶基因(UCE)、核糖体蛋白L8基因(RPL8)、核糖体蛋白S23基因(RPS23)、核糖体蛋白L2基因(RPL2)、细胞色素C基因(CYTC)、生长因子受体结合蛋白2基因(GFRP2)、肌动蛋白基因(ACT)和微管蛋白基因(TUB)进行表达稳定性评估分析。结果表明,菲律宾蛤仔不同发育时期qRT-PCR分析需要3个内参基因,分别为CYTC、CYTB5和RPS23;菲律宾蛤仔成体不同组织qRT-PCR分析需要2个内参基因,分别为CYTB5和GFRP2。ACT在蛤仔不同发育阶段和不同组织中表达最不稳定。 3、菲律宾蛤仔17个发育时期中Hox基因的表达分析 采用qRT-PCR技术对菲律宾蛤仔17个发育时期11个Hox基因的表达进行分析。结果发现:检测的11个Hox基因在原肠胚之前均不表达,并且菲律宾蛤仔Hox基因不具备时空共线性特点。菲律宾蛤仔Hox基因功能预测结果表明:Hox1、Hox4、Post1和Post2基因可能与菲律宾蛤仔初生壳形成有关;Antp与Hox5基因可能与菲律宾蛤仔底栖生活适应有关;Hox2和Hox3基因可能与菲律宾蛤仔足形成有关。该结果为深入研究Hox基因在菲律宾蛤仔发育过程中的生物学作用提供依据。