人细小病毒B19 (human parvovirus B19)属于细小病毒科红病毒属,是20nm-26nm的二十面体无包膜病毒,一般通过呼吸道进行传播,也可经输血、血液制品以及血-胎途径垂直传播。B19在发现新的病毒PARV、PARV5和博卡病毒(human bocavirus)之前被认为是细小病毒属中唯一对人类有致病性的病原体,可引起儿童的传染性红斑(第五病),在成人中可引起关节炎和关节病,感染孕妇可造成胎儿水肿及胎儿先天性贫血,严重时可导致胎儿死亡,对免疫缺陷患者会导致慢性贫血,短暂的再生障碍性危象等严重疾病,因此建立人细小病毒B19的检测方法十分必要。目前针对细小病毒B19的检测方法主要有血清学检测和PCR检测,分别针对血清中存在抗体和病原核酸进行检测。B19的PCR检测方法主要包括：普通PCR,巢氏PCR和荧光定量PCR (Real-time PCR)等,Real-time PCR检测方法由于其灵敏度高,特异性好,定量准确,并且具有实时监测和高通量的优势,是B19核酸检测的重要工具。如果在核酸提取体系中加入了竞争性内对照,竞争PCR则能够有效控制核酸提取和PCR扩增效率的差异,有利于排除假阴性结果。本研究首先建立了添加内对照的B19 DNA Real-time PCR检测方法；利用该方法检测人血清,获得了两个B19核酸阳性样本；然后设计了多套引物,使用巢氏PCR从一份阳性核酸中克隆除长末端(LTR)以外的B19全长序列,将PCR得到的基因片段连接到pMD18-T载体上,再使用预先设计好的酶切位点将所有片段连接起来得到B19的基因组。一、人细小病毒B19 Real-time PCR检测方法的建立实验目的：建立设有竞争性内对照的TaqMan探针Real-time PCR检测人细小病毒B19的方法,用于血清样本的检测。方法：首先确定血清中病毒核酸的提取方法,比较几种试剂盒的核酸提取效率,选择核酸获得率较高的一种；根据B19序列以及Real-time PCR要检测的序列设计四条引物,重叠延伸PCR(overlap extension PCR)方法合成B19-113片段,末端加A后连接至pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18T-B19-113作为标准DNA并建立标准曲线,使用相同方法构建重组质粒pMD18T-B19CT作为竞争性内对照(竞争性内对照与阳性对照的区别仅在于探针结合序列不同),同样建立标准曲线,确定血清核酸提取时内对照的添加量,建立Real-time PCR检测细小病毒B19的方法,使用建立好的方法进行血清标本检测。结果：确定了血清中病毒核酸的提取方法,分别成功构建了两种重组质粒,建立了Real-time PCR标准曲线和人血清细小病毒B19 Real-timePCR检测方法,灵敏度达1000geq/ml (genome equivalents per mL)血清；对160份血清样本进行了筛选,得到了2份B19阳性标本。结论：建立了人细小病毒B19荧光定量PCR检测方法,可以用于人血清B19的检测。二、B19基因组的克隆实验目的：分段克隆B19基因组序列,并将其拼接成完整的病毒基因组。方法：参考GenBank发表的B19基因组序列,依据单一限制性内切酶位点(共选择了6个位点),将全长基因组分为7段；设计7套巢式PCR引物,以B19阳性核酸(编号N105)为模板,使用巢氏PCR扩增7段B19基因序列；先将PCR产物克隆到pMD18-T载体上,限制性内切酶酶切鉴定后,进行序列测定；然后利用选定的限制性内切酶将克隆得到的片段依次酶切和连接,获得B19的基因组。结果：获得除长末端重复序列(LTR)外的B19基因组,并拼接得到质粒pMD-B23456,其含有的B19序列长4082 bp。全文结论：建立了人血清B19的Real-time PCR检测方法,其敏感度高,重复性好,可用于实际血清检测；克隆了一株除长末端重复序列以外的B19基因组,为B19的病毒学研究打下了基础。