皮肤老化主要包括时间性老化和光老化。时间性老化的皮肤随着时间的增长逐渐发生生理性改变，导致皮肤细微皱纹和皮肤易损。光老化是指由于日光紫外线辐射损害皮肤，导致皮肤提前发生老化改变。光老化皮肤的特征表现为深的皱纹形成、皮肤松弛、无光泽、粗糙和不规则黑色素沉着等。近些年来，人们对光老化造成的皮肤损伤及其防护措施日益关注，光老化形成机制成为研究热点。中医学理论认为，皮肤光老化发生的病因病机主要是由于机体禀赋不耐、肤腠不固、饮食不节，复感光毒侵袭，导致气血亏虚、痰瘀阻滞，日久“正虚邪实”，皮肤失养而表现出一派衰老枯萎之象。近年来，中药绞股蓝被诸多研究者所重视，列入了抗光老化药物的研究队伍。绞股蓝为葫芦科植物绞股蓝的根茎或全草,其性甘、微苦、寒，归脾、肺、心、肾经，具有益气健脾、清肺化痰和清热解毒的功效。我们在前期体内实验研究中已经证明绞股蓝具有抗皮肤光老化的作用。现代药理研究证明绞股蓝含有绞股蓝皂苷、绞股蓝糖苷（多糖）、水溶性氨基酸、黄酮类、多种维生素、微量元素、矿物质等，主要活性成分为绞股蓝总皂苷，具有降血压、降血脂、降血糖、抗衰老、抗疲劳、抗缺氧、抗高温、抗低温、延长生命、升高SOD活性和提高免疫等功效。紫外线中，长波紫外线UVA(320～400nm)和中波紫外线UVB(290～320nm)均可引起皮肤的光老化损伤，其中，皮肤角质细胞吸收大部分UVB辐射。目前，皮肤光老化的分子机制尚未被完全阐明，但已有研究表明，紫外线辐射皮肤角质细胞，通过促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，激活核因子κB (NF-κB)，同时诱导c-Jun表达上调，c-Jun与构成型表达的c-Fos结合成转录因子激活蛋白1（AP-1）。AP-1和NF-κB，均可激活基质金属蛋白酶（MMP）和细胞因子的表达，从而损害真皮细胞外基质（胶原组成部分）引发皮肤光老化损伤。此外，被激活后的转录因子NF-κB能够进一步刺激前炎症细胞因子等的表达，反过来这些细胞因子通过细胞表面因子受体活化AP-1和NF-κB，形成一个恶性循环，放大紫外线辐射效应。紫外线辐射诱导MAPK信号通路的激活在皮肤光老化病变过程中起重要作用，其中，p38MAPK信号通路与紫外线辐射诱导的细胞应激反应关系密切。目的：模拟日光与人体皮肤环境，以光老化人皮肤角质细胞p38MAPK信号通路改变为研究核心，利用免疫学与分子生物学技术，从体外阐明绞股蓝总皂苷抗皮肤光老化的作用机制，为后续研究绞股蓝总皂苷含药血清对光老化人皮肤成纤维细胞的影响及中医药防治皮肤光老化提供新的思路方法与科学理论依据。材料与方法：第一部分：常规饲养人永生化角质形成细胞株（HaCaT），绘制生长曲线；倒置显微镜下观察HaCaT细胞形态，采用免疫细胞化学法检测HaCaT细胞中角蛋白的表达，鉴定人皮肤角质细胞；采用绞股蓝总皂苷给予大鼠经口灌胃，制备不同浓度的绞股蓝总皂苷含药血清，MTT法检测绞股蓝总皂苷含药血清对HaCaT细胞的毒性作用；采用UVB303nm照射HaCaT细胞，MTT法检测照射后的细胞增殖活性，确定光老化人皮肤角质细胞模型的UVB照射剂量。第二部分：实验分组及干预方法如下：正常对照组（Ⅰ组），未经干预正常饲养的HaCaT细胞；UV模型组（Ⅱ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以新鲜培养液培养；空白血清组（Ⅲ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以空白大鼠血清干预；低剂量含药血清组（Ⅳ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以含低剂量绞股蓝总皂苷大鼠血清干预；中剂量含药血清组（Ⅴ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以含中剂量绞股蓝总皂苷大鼠血清干预；高剂量含药血清组（Ⅵ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以含高剂量绞股蓝总皂苷大鼠血清干预；p38MAPK抑制剂组（Ⅶ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以p38MAPK抑制剂SB203580（浓度为5μmol/L）干预。采用RT-PCR方法对各组细胞p38MAPK、MMP-1、c-Jun和c-Fos mRNA表达水平进行检测；采用Western blot方法对各组细胞p38MAPK、MMP-1、c-Jun和c-Fos蛋白表达水平进行检测。第三部分：实验分组及干预方法如下：正常对照组（Ⅰ组），未经干预正常饲养的HaCaT细胞；UV模型组（Ⅱ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以新鲜培养液培养；空白血清组（Ⅲ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以空白大鼠血清干预；低剂量含药血清组（Ⅳ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以含低剂量绞股蓝总皂苷大鼠血清干预；中剂量含药血清组（Ⅴ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以含中剂量绞股蓝总皂苷大鼠血清干预；高剂量含药血清组（Ⅵ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以含高剂量绞股蓝总皂苷大鼠血清干预；p38MAPK抑制剂组（Ⅶ组），采用剂量为35mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞，照射后以p38MAPK抑制剂SB203580（浓度为5μmol/L）干预。采用ELISA方法对各组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量进行检测；采用RT-PCR方法对各组细胞NF-κB mRNA表达水平进行检测；采用Western blot方法对各组细胞NF-κB蛋白表达水平进行检测。结果：第一部分：1. HaCaT细胞生长曲线显示：生长期为第14天，从第4天开始进入平台期。2.倒置显微镜下，HaCaT细胞贴壁生长，形态呈圆形、椭圆形，细胞间排列紧密，呈典型的铺路石样排列。3.细胞角蛋白在HaCaT细胞内稳定表达，HaCaT细胞抗角蛋白5染色阳性，胞浆内见棕褐色阳性颗粒；阴性对照未见阳性表达。4.绞股蓝总皂苷含药血清干预后HaCaT细胞增殖活性变化显示：随着绞股蓝总皂苷含药血清浓度的增高，各组细胞增殖活性无显著性差异（P＞0.05），绞股蓝总皂苷含药血清对HaCaT细胞无明显抑制或促进生长作用。5.随着UVB照射时间的加长即照射剂量的不断加大，倒置显微镜下，HaCaT细胞逐渐回缩、变圆、细胞间隙明显加大、细胞紊乱和漂浮细胞增多；UVB照射后HaCaT细胞增殖活性变化显示：随着UVB照射时间的加长即照射剂量的不断加大，各照射组细胞活性明显减弱（P＜0.05），在UVB照射第1分钟内变化最为明显，之后也有变化，但显著性下降，且逐渐趋于平缓。第二部分：1.各组细胞p38MAPK、c-Jun mRNA和蛋白表达水平检测结果显示：正常对照组细胞p38MAPK、c-Jun mRNA和蛋白表达水平较低，UV模型组二者的表达水平显著增高，与正常对照组比较有统计学意义（P＜0.01）；与UV模型组比较，p38MAPK抑制剂组、低、中、高剂量含药血清组细胞p38MAPK、c-Jun mRNA和蛋白表达水平显著下调，有统计学意义（P＜0.01）；与高剂量含药血清组比较，中、低剂量含药血清组细胞p38MAPK、c-Jun mRNA和蛋白表达处于相对高水平，有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。2.各组细胞MMP-1、c-Fos mRNA和蛋白表达水平检测结果显示：各组细胞MMP-1mRNA和蛋白表达水平极低，各组间无显著性差异（P＞0.05）；各组细胞c-Fos mRNA和蛋白表达水平均一，组间比较无显著性差异（P＞0.05）。第三部分：1.各组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量检测结果显示：正常对照组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量较低，与正常对照组比较，UV模型组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著升高，有统计学意义（P＜0.01）；与UV模型组相比，p38MAPK抑制剂组、低、中、高剂量含药血清组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著下降，有统计学意义（P＜0.01）；与高剂量含药血清组比较，中、低剂量含药血清组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量处于相对高水平，有统计学意义（P＜0.01）。2.各组细胞NF-κB mRNA和蛋白表达水平检测结果显示：正常对照组细胞NF-κB mRNA和蛋白表达处于低水平，UV模型组细胞NF-κB mRNA和蛋白表达水平显著上调，与正常对照组比较有统计学意义（P＜0.01）；与UV模型组比较，p38MAPK抑制剂组、低、中、高剂量含药血清组细胞NF-κB mRNA和蛋白表达水平显著下调，有统计学意义（P＜0.01）。结论：1.绞股蓝总皂苷含药血清对HaCaT细胞无明毒性作用。2.采用UVB照射HaCaT细胞建立光老化人皮肤角质细胞模型，UVB照射剂量以35mJ/cm2较为合适。3. UVB照射可能是通过激活p38MAPK信号通路从而引发人皮肤角质细胞光老化损伤。4.绞股蓝总皂苷可用于防治皮肤光老化，其作用机制可能是绞股蓝总皂苷含药血清抑制p38MAPK信号通路对UVB照射引发的人皮肤角质细胞光老化损伤起到良好的光保护作用。