目前多肽类药物应用越来越广泛，然而由于化学合成成本高、天然产量低和提取困难，利用化学合成和直接从天然产物中提起难以制备大量的目的蛋白，利用基因工程技术生产多肽药物具有成本低、产量高和提取方法容易等优点，是获取多肽类药物的一条有效途径。毕赤酵母表达系统是近年来迅速发展的一种真核表达系统，它具有表达量高、稳定性强、糖基化程度低等优点，且兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的翻译后加工的双重特点，因此成为多肽类药物的首选表达系统。 Exendin-4是从美国毒蜥唾液中分离出来的胰高血糖素样肽1(Glucagon-likepeptide-1，GLP-1)类似物，由39个氨基酸组成，Exendin-4具有高效降血糖、减轻体重、促进β细胞新生、显著改善β细胞分泌等助能，并且副作用小，因而成为治疗2型糖尿病的新亮点。本课题通过重叠PCR法合成Exendin-4基因全序列，将其克隆入表达质粒pPIC9KH中，通过鉴定并测序正确后，电转化真核表达宿主-毕赤酵母菌株GS115，通过营养缺陷型培养基筛选重组子，再利用G418抗性筛选出整合有多拷贝外源基因的重组子，成功表达了目的蛋白Exendin-4，但表达量低，推测是受蛋白小肽较小(4.3 KD)的影响。 为了获得高表达量的Exendin-4，采用Exendin-4与其它蛋白融合表达的策略。另外，融合蛋白技术不仅提高了融合蛋白的分子量，还可发挥不同蛋白的协同作用。胸腺肽β4(thymosinβ4，Tβ4)是一种具有改善机体免疫功能、促进神经系统发育、创伤愈合以及抑制细胞凋亡等功能由43个氨基酸组成的小肽，研究表明其可以用于治疗糖尿病皮肤溃疡和促进β细胞增殖。本研究采用融合蛋白技术将Tβ4和Exendin-4融合表达，并其问引入凝血酶酶切位点，以期获得高表达的多靶点、多功能的糖尿病治疗蛋白。通过重叠PCR法合成Ex4-Tβ4融合蛋白的基因全序列，将其克隆入含有组氨酸标签的表达质粒pPIC9KH获得重组载体。电转化毕赤酵母GS115，通过营养缺陷型和G418抗性筛选获得整合有多拷贝外源基因的重组子，并挑选出具有高分泌表达水平的菌株。并对其表达条件进行优化，获得大规模发酵的合适条件，采用镍柱亲和层析纯化分离目的蛋白，经透析除盐后冷冻干燥制成干粉，获得大量纯化的Ex4-Tβ4融合蛋白，为糖尿病及其引起的皮肤溃疡并发症的协同治疗提供目标融合蛋白。