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背景与目的：目前，在包括我国在内的多数国家和地区，肺癌已占男性各种癌症发病率的首位。近年来分子靶向治疗作为治疗肿瘤的新方法，以其针对性强，不良反应小，疗效肯定被广泛关注，临床应用越来越多。然而分子靶向药物因其容易产生耐药而致其疗效维持时间短，中位疾病进展时间为6～8个月。因此，研究分子靶向药物的耐药机制，探讨增强此类药物敏感性的方法，已成为亟待解决的问题。自噬（Autophagy）是指在细胞营养不良时分解较不重要的细胞结构来提供养份，以满足细胞代谢需要并维持细胞内稳态的现象。已有文献表明，肿瘤细胞可通过提高自噬水平而抵抗放化疗打击。因此，自噬也可能在肿瘤细胞靶向药物耐药机制中发挥作用。本研究拟探讨自噬在A549肺腺癌细胞耐厄洛替尼中的作用。材料和方法：1．细胞培养：人肺腺癌A549细胞株培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，A549/ER细胞培养于厄洛替尼终浓度为25μM的RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清），两种细胞均置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，取对数生长期细胞为实验对象。2．MTT实验：A549细胞及A549/ER细胞以5x103/孔接种于96孔板中，培养24h后加厄洛替尼0.01μM、0.1μM、1.0μM、10μM和100μM，同时设对照组（0.1%DMSO）和空白组，每组5个复孔。培养48h后，每孔加入浓度5mg/ml MTT的溶液20μL，孵育4h后，弃上清，加入150μL DMSO，置摇床低速振荡10min，用酶标仪检测求出570nm处的OD值。根据公式求出相应的细胞生长抑制率，求得IC50值。3．细胞免疫荧光测定MAP1-LC3-Ⅱ：A549细胞及A549/ER细胞以1x105/孔接种于24孔板，培养24h细胞贴壁后，分别加入含5μM、25μM厄洛替尼的培养基继续培养6h，同时设对照组（0.1%DMSO），每组3个复孔。6h后4%多聚甲醛固定15min，含0.1%的Triton-X100的洗涤液于摇床上洗涤3次，每次3-5分钟，含5%BSA的封闭液封闭60分钟，500μL稀释的兔抗人Anti-LC3B（1：100），4℃作用过夜，洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟，1ml稀释的抗兔FITC（1：1000），室温下置于摇床避光孵育60分钟，洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟（避光操作），DAPI染核5min后置于荧光倒置相差显微镜下观察。4．Western Blot检测MAP1-LC3-Ⅱ的表达：按5x104/孔接种A549细胞及A549/ER细胞于六孔板中，培养24h后加入厄洛替尼1μM、5μM、25μM，同时设对照组（0.1%DMSO），分别于加药后3h、6h、9h、12h后提取蛋白，调整蛋白浓度后变性，12%SDS-PAGE分离蛋白，转膜后5%脱脂牛奶封闭6h，一抗[Anti-LC3B（1:1000）；GAPDH（1:1000）]4℃作用过夜，TBST洗膜，ECL发光剂显影，重复3次实验后用Quantity One软件ChemiDOCXRS成像系统采集图像，计算各组LC3-Ⅱ/GAPDH灰度比值。5．流式细胞仪检测细胞周期与细胞凋亡率：A549/ER细胞按1x106/瓶接种于4瓶75ml的培养瓶内，培养24h后分别予以以下处理：①0.1%DMSO；②3-MA5mM处理2h；③厄洛替尼100μM；④3-MA5mM预处理2h后加入厄洛替尼100μM。置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24h后收集细胞加入70%预冷乙醇1ml，混匀4℃固定12h，离心去上清，PBS洗两次，加入碘化丙啶（propidium iodide,PI）染液1ml，37℃水浴箱静置30min，用流式细胞仪检测细胞周期与细胞凋亡率。结果：1.在相同浓度厄洛替尼作用下，A549/ER细胞株较A549细胞株抑制率降低，说明本实验室成功地诱导出人肺腺癌耐厄洛替尼细胞株A549/ER。2.厄洛替尼作用癌A549细胞株及A549/ER细胞株后，具有特征的绿色荧光的MAP1-LC3-Ⅱ蛋白的表达较未予药物处理的细胞明显增多，说明厄洛替尼可诱导A549及A549/ER细胞自噬产生。3.低浓度（1、5μmol/L）厄洛替尼作用下，A549细胞及A549/ER细胞LC3-Ⅱ表达较对照组均升高；而高浓度（25μmol/L）厄洛替尼作用下，A549细胞LC3-Ⅱ表达较低浓度时降低，A549/ER细胞LC3-Ⅱ表达仍较低浓度时升高。4.5mM自噬抑制剂3-MA抑制A549/ER细胞的自噬能力后，细胞的凋亡率从7.76%升高至18.85%，可见抑制自噬后，细胞的凋亡增多。结论：1.厄洛替尼可诱导人肺腺癌A549细胞株及人肺腺癌耐厄洛替尼细胞株A549/ER发生自噬。2. A549/ER细胞株较A549细胞株具有更强的自噬能力。3.自噬作用有利于A549/ER细胞在高浓度厄洛替尼作用下的存活；自噬是A549细胞耐厄洛替尼的作用之一。