中间偃麦草类萌芽素蛋白基因TiGLP1的功能分析及小麦TaGLP基因家族分析

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当今世界小麦播种总面积、小麦总产量和总库存量在谷类作物中均占据首位,以小麦为主要粮食的人口占世界人口总数的三分之一以上。同时小麦也是我国主要的三大粮食作物之一,小麦产量决定国家粮食安全。目前各种白粉病等真菌性病害严重影响小麦的产量,因此良好抗病基因的鉴定和利用有助于提高小麦的抗病性。在植物遭受胁迫时,类萌芽素基因GLPs在发育、防御和应激等方面挥重要作用。在本研究中,在前期通过对白粉病诱导的小偃麦SN6306转录组分析的基础上,从中鉴定到一个来自中间偃麦草且受白粉病菌诱导的类萌芽素基因TiGLP1,进一步对TiGLP1基因进行了功能分析;同时对小麦TaGLP基因家族进行分析鉴定。主要结果如下:(1)TiGLP1基因的克隆将小麦白粉病生理小种E09诱导后的小偃麦SN6306进行转录组测序,对其中明显上调表达的差异基因TiGLP1基因进行克隆。利用在线软件对基因序列分析表明,TiGLP1基因cDNA全长为651 bp,ORF编码216个氨基酸的蛋白质。有22个氨基酸残基的信号肽。对14个物种GLPs蛋白序列进行比对和进化树分析,比对发现TiGLP1的氨基酸序列与中间偃麦草中扩增得到的TiGLP2相似较高。进化树聚类可看出他们亲缘关系较近。用白粉病菌侵染SN6306验证转录组结果,以及通过实时荧光定量分析结果表明白粉病菌诱导TiGLP1基因的表达升高,呈现出先升高后降低的表达模式。与0h相比TiGLP1基因在72 h表达达到峰值,是0 h的3.5倍。(2)TiGLP1功能初步分析亚细胞定位显示定位在胞外,是一种分泌蛋白。利用同源重组法构建了转化烟草过表达载体pRI101-TiGLP1,采用叶盘法转化获得了转TiGLP1基因的烟草。然后将Pst DC3000稀释菌液喷施T2代转基因烟草,收集处理5 d后的叶片进行DAB染色和台盼蓝染色用来检测叶片中活性氧和坏死细胞,结果表明转TiGLP1基因烟草中活性氧(ROS)积累和坏死细胞面积比野生型本生烟草多。因此说明TiGLP1基因可以增强烟草对Pst DC3000的抗性。(3)TaGLP基因家族分析通过小麦全基因组分析总共鉴定出258个小麦GLPs成员,其中亚基因组A、B和D的GLPs家族成员分别有69、86和62个,其中还包含41个在未知染色体。系统发育进化关系显示TaGLP基因在单子叶植物和双子叶植物中具有特殊偏好性,而TaGLP基因则晚于单子叶植物和双子叶植物分化。TaGLP基因在不同亚家族之间的基因结构和保守基序有很大差异,每个亚家族之间具有一定的相似性。中国春转录组分析发现,小麦白粉病侵染过程中36个TaGLP上调表达,其中21个位于小麦4A、4B和4D染色体上。说明小麦的第四同源群在抗病性中起重要作用,qRT-PCR分析进一步证实了它们的上调表达。
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