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目的：通过构建可同时携带stathmin和bcl-2基因RNA干扰序列的慢病毒载体，包装成慢病毒，进行体外实验，观察对双基因的沉默作用及抗肿瘤效应，探讨逆转紫杉醇耐药的可行性，为临床克服肿瘤耐药提供实验依据。 方法：1.诱导人肺腺癌紫杉醇耐药细胞(A549/Tax)，采用浓度递增和短时作用法诱导，紫杉醇药物从低浓度0.01μg/ml开始逐渐加大剂量，直至51.2μg/ml，最终使A549细胞能够在1.28μg/ml紫杉醇浓度下长期培养生长，即成为人肺腺癌紫杉醇耐药株A549/Tax。绘制生长曲线和计算细胞倍增时间；CCK-8法测A549和A549/Tax细胞的耐药指数和抑制率。 2.利用三质粒包装系统(包装质粒△NRF、包膜蛋白质粒pVSVG、转移质粒PLB-bc1-2-stathmin/shRNA、PLB-bc1-2shRNA和PLB-stathmin/shRNA)在人胚肾293FT细胞中产生病毒颗粒，通过荧光显微镜观察计数EGFP阳性细胞法进行病毒滴度的测定。 3.用包装好的分别包含质粒PLB-bc1-2-stathmin/shRNA、PLB-bc1-2shRNA和PLB-stathmin/shRNA慢病毒分别感染A549/Tax细胞，分别命名为双靶点B-SA549/Tax细胞组、bc1-2 A549/Tax细胞组stathmin A549/Tax细胞组通过荧光显微镜观察计数EGFP阳性细胞法进行靶细胞感染率的测定。 4.分别用A549/Tax细胞组、B-S A549/Tax细胞组、bc1-2 A549/Tax细胞组和stathmin A549/Tax细胞组提取RNA，RT-PCR检测目的基因bc1-2、stathmin mRNA表达；Western-blotting测目的蛋白bc1-2、stathmin表达。 5.加紫杉醇后用CCK-8法检测A549细胞组、A549/Tax细胞组、B-S A549/Tax细胞组、bc1-2 A549/Tax细胞组和stathmin A549/Tax细胞组的增值情况。检测逆转耐要相关指标：细胞生长抑制率(IR)、细胞半数抑制浓度(IC50)、耐指数(RI)、相对逆转效率。 结果：1.诱导A549/Tax细胞，使该细胞能在一定浓度的紫杉醇环境里生长。A549和A549/Tax细胞生长曲线比较显示，A549/Tax细胞增殖较亲本细胞快，指数生长期稍早出现(传代后3～4 d)，而A549细胞指数生长期则存第4～5天。A549和A549/Tax细胞倍增时间分别为33.466±0.583d小时和42.3404±1.490小时，耐药细胞倍增时间是亲代细胞的1.265倍(P<0.05)，增殖速度明显减慢。 2.加紫杉醇后，A549/Tax细胞相对A549细胞耐药指数升高。A549对紫杉醇的IC50为0.0167±0.0026mg/L，A549/Tax细胞对紫杉醇的IC50为0.5933±0.4611mg/L，A549/Tax细胞对Tax的耐药指数(R I)为36.08±4.86倍(P<0.05)。 3.用转移质粒(PLB-bc1-2-stathmin/shRNA、PLB-bc1-2shRNA和PLB-stathmin/shRNA)、包装质粒△NRF和包膜蛋白质粒VSV-G共转染293FT病毒包装细胞后，荧光显微镜下观察到较强的绿色荧光蛋白表达，转染率约为80％。表明慢病毒颗粒包装正确。 4.用包装好的慢病毒干扰载体分别感染A549/Tax细胞，48小时后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达，转染率约为53.6±2.4％，表明转染成功。 5.RT-PCR及Western-blot显示bc1-2 A549/Tax细胞组，对bc1-2在mRNA水平的抑制率为23±0.01％，在蛋白水平的抑制率为12±0.01％(P<0.05)；stathminA549/Tax细胞组，对stathmin在mRNA水平的抑制率为20±0.02％，在蛋白水平的抑制率为17±0.02％(P<0.05)；双靶点B-S A549/Tax细胞组，对bc1-2在mRNA水平的抑制率为57±0.01％，在蛋白水平的抑制率为55±0.02％(P<0.05)，对stathmin在mRNA水平的抑制率为62±0.01％，在蛋白水平的抑制率为49±0.02％(P<0.05)；A549/Tax细胞组stathminm和bc1-2的mRNA和蛋白表达明显高于A549细胞(P<0.05)。 6.加紫杉醇后，CCK-8结果显示随着紫杉醇浓度的增大，对肿瘤细胞的抑制增值效应增强，相同浓度下，bc1-2 A549/Tax细胞组和stathmin A549/Tax细胞组抑制率增加，双靶点B-S A549/Tax细胞组抑制率增加最明显；(P<0.05)，A549细胞组IC50值为0.015；A549/Tax细胞组IC50为0.646、耐药指数(RI)为43.06；bc1-2 A549/Tax细胞组IC50为0.442、RI为29.47、相对逆转率为32.33％；stathminA549/Tax细胞组IC50为0.376、RI为25.06、相对逆转率为42.79％；双靶点B-S A549/Tax细胞组IC50为0.227、RI为15.13、相对逆转率为66.40％。 结论：1.成功诱导出人肺腺癌紫杉醇耐药细胞(A549/Tax细胞)。 2.完成了双靶点PLB-bc1-2-stathmin/shRNA慢病毒载体包装细胞系、单个靶点PLB-bc1-2shRNA和PLB-stathmin/shRNA慢病毒载体包装细胞系的建立，完成了对A549/Tax细胞的慢病毒包装。 3.单个靶点的体外RNA干扰可有效沉默A549/Tax细胞内stathmin和bc1-2基因的表达，两个单靶点干扰均可抑制A549/Tax细胞增殖，逆转其紫杉醇耐药； 4.双靶点联合干扰的效果更明显，从而为多靶点基因治疗提供新思路。