肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,以下简称肝癌,HCC)是世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一,其病死率在全球所有癌症中占第3位,是我国第2位癌症死亡原因。手术切除仍是目前肝癌获得长期生存的主要手段。但术后5年复发率高达60%以上(小肝癌也达40%～50%)。转移复发己成为进一步延长肝癌病人生存期、提高远期疗效的瓶颈问题,也是最终攻克肝癌的关键。因此,筛选肝癌转移相关基因,探明肝癌转移的分子机制,寻找有效的防治手段成为进一步提高肝癌治疗效果的关键。HTPAP基因是肿瘤相关基因,其正式名为PPAPDC1B(Phosphatidic acidphosphatase type 2 domain containing 1B),含有1B功能域的2型磷脂酸磷酸酯酶。该基因定位于8p12,含有7个外显子、6个内含子。基因全长4459 bp,cDNA长为826 bp,编码一个具有175个氨基酸的蛋白质。已有研究发现一些人类肿瘤中该基因的异常转录表达,提示该基因具有抑制肿瘤细胞增殖、降低侵袭性、抑制肿瘤转移的作用。我们前期经体内、体外研究初步证实该基因可抑制HCC的侵袭和转移,提示HTPAP基因是一新的HCC转移抑制基因。前期研究中,我们初步通过对肝癌病人肿瘤组织HTPAP基因的单核苷酸多态性分析研究发现,HCC病人HTPAP基因上的rs1149位点存在C→G多态性。伴有肝内播散和/或脉管侵犯的病人血浆循环DNA rs1149位点GG+GC基因型频率和G等位基因频率分别为61%和39%,明显高于不伴有肝内播散和脉管侵犯的病人该位点GG+GC基因型频率和G等位基因频率(分别为39%和24%),二组差异显著(P=0.046,P=0.026)。rs1149位点GG+GC基因型与肿瘤数目P=0.026),TNM分期(P=0.026),病人无瘤生存率(P=0.005)和总体生存率(P=0.014)均密切相关。rs1149位点上的C→G多态性可能影响HTPAP基因的表达或引起基因编码的蛋白质及其功能的改变,从而导致HCC病人肿瘤侵袭性的增高。基于上述理论和实验基础,本实验拟应用激光捕获组织显微切割获取纯肝癌组织DNA,对HTPAP基因的SNP位点进行检测并行单体型构建,探讨HTPAP基因的SNP、单体型与肝癌转移潜能的关系及其相关机制,以及与肝癌病人转移复发和预后的关系。第一部分肿瘤抑制基因HTPAP的SNP检测、单体型构建及其与肝癌侵袭性能的关系探讨目的:在前期研究基础上通过对大样本的HCC病人肿瘤组织DNA的HTPAP基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)检测、单体型构建后,探讨其与肝癌侵袭性关系。方法:应用激光捕获组织显微切割从864例HCC手术样本中获取相对纯的HCC细胞、提取DNA,对30例HCC的HTPAP基因全长和5’、3’-flanking region(侧翼区)的3kb启动子区域进行ABI仪测序发现SNP位点后,应用焦磷酸测序仪行864例样本SNP检测,并予单体型构建,分析其与肝癌侵袭转移潜能(有无肝内播散,脉管癌栓)的关系。结果:在7.5 Kb测序区域中,共发现6个SNP位点[-1053 A/G、+64G/C、+357C/G、+1648-/TAAG(无插入和插入TAAG等位基因分别以T/G示,后同)、+1838A/G、+3528C/T]。单体型构建研究发现HTPAP中共存在12种单体型,其中A-G-C-T-A-C,G-C-G-G-G-T,A-G-C-T-G-C,G-C-G-G-A-T(依次为6个SNP的等位基因:+3528C/T—+1838A/G—+1648-/TAAG—+357C/G—+64G/C—-1053A/G,后同)四种单体型占94.62%。793例(占91.78%)HCC由该4种单体型构成。5个SNP(-1053 A/G、+64G/C、+357C/G、+1648-/TAAG、+3528C/T)表现为强连锁不平衡关系(r~2=0.85-1.0),而+1838A/G出现重组现象,与上述5个SNP连锁较弱(r~2=0.32-0.36);临床病理特征分析提示SNP+357C/G的基因型GG+GC与HCC高侵袭转移潜能正相关[GC:OR=1.77,95%C.I.=1.32-2.36,P=0.0001;GG:OR=2.11(1.28-3.48),P=0.003],呈等位基因G剂量依存性。而+1838A/G虽然处于外显子之中,但是与HCC侵袭转移潜能并无相关[GA:OR=1.09(0.81-1.46),P=0.564;GG:OR=1.39(0.91-2.12),P=0.126]。单体型G-C-G-G-G-T与高侵袭转移潜能正相关[OR=1.50(1.18-1.91),P=0.001],而G-C-G-G-A-T,A-G-C-T-A-C和A-G-C-T-G-C则与HCC侵袭性无关。结论:肿瘤转移抑制基因HTPAP的TagSNP+357 GG+GC基因型和G-C-G-G-G-T单体型与HCC高侵袭转移潜能正相关,针对不同SNP基因型和单体型分析可能会为肝癌转移复发、预后预测提供新的途径和分子遗传学指标。第二部分HTPAP基因的SNP基因型和单体型影响肝癌侵袭转移潜能的相关机制研究及其对预后的影响一、HCC中HTPAP单体型与基因表达关系目的:检测HCC中HTPAP基因的表达,探讨HTPAP基因的TagSNP+357C/G基因型和相关的单体型对与基因表达的的影响。方法:(1)构建pEGFP-HTPAP载体真核表达质粒,应用绝对定量PCR(quantitative real-time PCR)检测HCC中HTPAP RNA的表达(含3种同素异构体).(2)随机选取170例以A-G-C-T-A-C,G-C-G-G-G-T,A-G-C-T-G-C和G-C-G-G-A-T等四种HTPAP基因主要单体型组成的HCC组织,并提取总RNA。结果:成功构建pEGFP-HTPAP载体真核表达质粒。对4种单体型组成的170例HCC进行HTPAP基因表达水平的定量分析,其中GCGGGT纯合子21例、AGCTAC纯合子65例、AGCTAC/GCGGGT杂合子52例、AGCTAC/GCGGAT杂合子13例、AGCTAC/AGCTGC杂合子19例。发现HCC中HTPAP基因表达在AGCTAC纯合子和AGCTAC/AGCTGC杂合子病人较GCGGGT纯合子、AGCTAC/GCGGGT杂合子和AGCTAC/GCGGAT杂合子表达升高,但未达到统计意义(P＞0.05)。结论:HCC中不同HTPAP单体型能影响HTPAP表达水平,但是无统计学差异。二、HCC中HTPAP基因启动子单体型与转录活性的关系目的:通过构建HTPAP的3个启动子单体型,探讨不同HTPAP启动子单体型对基因转录活性的影响。方法:PCR方法克隆出跨越基因上游5’-flanking的-1764bp至基因内部+315bp的启动子序列(2079bp)。该区域含-1053AG和+64GC两个SNP,由于存在完全LD,故只有三种单体型(-1053 AA/+64GG、-1053 AG/+64 GC和-1053 GG/+64 CC),上述HTPAP启动子单体型pGL3质粒,并分别转染MHCC-97H、HepG2肝癌细胞和Hela细胞,采用双荧光报告法,检测荧光素酶的活性,重复3次。结果:三种单体型的HTPAP启动子都具有显著转录活性(与空pGL3-basic质粒相比),其中-1053 AA/+64GG单体型启动子转录活性明显强于-1053 GG/+64 CC(P=0.005)和-1053 AG/+64 GC单体型启动子(P=0.009)。而-1053GG/+64 CC和-1053 AG/+64 GC启动子单体型间未见明显差异(P=0.26)。结论:HTPAP启动子SNP(-1053AG和+64GC)的不同单体型对基因的转录活性有显著影响,能启动不同水平的基因转录。三、利用基因芯片研究HTPAP单体型调控HCC侵袭转移潜能的调控机制目的:应用表达谱芯片分析不同单体型HCC的差异表达,探不同单体型HTPAP基因影响HCC的侵袭性潜能可能机制。方法:选择GCGGGT和AGCTAC纯合子的HCC各16例,应用AffymetrixHuman Genome U133表达谱芯片进行分析,SAM分析(Significant Analysis ofMicroarray)两组表达谱差异,并聚类分析后,Real-time PCR法进行验证;在此分析基础上,另外分别选择GCGGGT纯合子、AGCTAC纯合子、GCGGGT/AGCTAC杂合子、AGCTAC/AGCTGC杂合子、GCGGAT/AGCTAC杂合子HCC各4例,行聚类分析验证等。结果:我们对GCGGGT和AGCTAC纯合子HCC各16例行SAM分析发现41个差异表达基因(包括2个转录本),其中以IL-8在GCGGGT上调表达8倍;聚类分析发现该41个差异表达基因(转录本)可以将两组很好地区分开来。同时应用该41个差异表达基因(转录本)对后续20例HCC聚类分析发现可以将GCGGGT纯合子、AGCTAC纯合子、GCGGGT/AGCTAC杂合子、AGCTAC/AGCTGC杂合子、GCGGAT/AGCTAC杂合子等五组HCC很好地区分为两大组:即GCGGGT纯合子+GCGGGT/AGCTAC杂合子+GCGGAT/AGCTAC杂合子和AGCTAC纯合子+AGCTAC/AGCTGC杂合子。同时对总52例HCC聚类分析见相似结果。52例中临床表型分析发现前组的28例中有19例具有高侵袭转移潜能,而后组24例中有8例具有高侵袭转移潜能(P=0.025)。Real-time PCR和RT-PCR均验证了上述差异表达。结论:不同HTPAP单体型的HCC具有不同的基因表达谱,这些在不同HTPAP单体型HCC中具有显著差异表达的基因可能于HTPAP基因有关,并影响肝癌的不同临床表型,改变其侵袭转移潜能,提示HCC中HTPAP的不同单体型可能是潜在侵袭转移相关的预测指标。四、不同SNP基因型和单体型HTPAP蛋白在肝癌中的表达及其与术后无瘤生存(术后复发)的关系目的:检测不同单体型的HCC中HTPAP蛋白的表达,探讨两者间的关系;检测665例HCC的6个SNPs位点,探讨SNPs和单体型与预后的关系。方法:(1)应用免疫组织化学染色方法,观察HTPAP蛋白在377例HCC中的表达,分析SNPs和单体型与蛋白表达的关系;(2)显微切割2002—2003年手术切除的具有完整术后随访资料的665例HCC的石蜡包埋的肿瘤组织样本,提取DNA,应用焦磷酸测序方法对6个SNPs进行检测、单体型构建后,并统计665例术后无瘤生存时间(DFS,Disease-free Survival),探讨SNPs基因型、单体型与术后DFS(术后复发)的关系。结果:(1)HTPAP蛋白的表达在377例HCC中有177例阳性染色(+～+++),占46.9%。染色特点与肝癌侵袭转移潜能(有无肝内播散灶和脉管癌栓)分析发现,377例中193例具有高侵袭转移潜能的HCC中有80例HTPAP染色为阳性(41.5%),而184例低高侵袭转移潜能的HCC中有97例为HTPAP染色阳性(52.7%)(P=0.028),提示HCC的侵袭转移潜能与HTPAP蛋白表达负相关。TagSNP+357C/G基因型与HTPAP染色发现GG+GC基因型的HCC较CC型的HTPAP蛋白表达低(P=0.002);而TagSNP+1838A/G分析发现GG+GA基因型的HCC较AA型的HTPAP蛋白表达无统计差异低(P=0.130)。单体型分析发现GCGGGT+GCGGAT单体型HCC较其它单体型的HTPAP表达亦显著降低(P=0.001),免疫组化染色分析提示不同的单体型能影响HTPAP蛋白的表达水平。Kaplan-Meier生存曲线分析提示:TagSNP+357GC的Genotype为GG,GC,CC的HCC之间的术后无瘤生存时间具有统计差异,Genotype为CC的HCC术后无瘤生存较为GG和GC明显好(P＜0.001);而TagSNP+1838A/G的Genotype为GG,GA,AA的HCC之间的术后无瘤生存时间无统计差异(P=0.282)。单体型与预后分析发现GCGGGT纯合子较GCGGGT杂合子和其它单体型术后无瘤生存差(P＜0.001),提示具有较高的术后复发风险。Cox风险比例模型多因素分析发现TagSNP+357 GG+GC基因型和GCGGGT纯合子或杂合子单体型是术后无瘤生存(术后复发)差的独立相关因子(分别为GG:P=0.021,HR(HazardRatios)=1.51,95%C.I.=1.07-2.15,GC:P=0.030,HR=1.29,95%CI=1.03-1.62;GCGGGT纯合子:P=0.009,HR=1.59,95%C.I.=1.12-2.27,GCGGGT杂合子:P=0.022,HR=1.32,95%C.I.=1.04-1.67)。结论:我们研究表明肿瘤转移抑制基因HTPAP上的SNPs会改变肿瘤的侵袭转移潜能。(1)Tag+357 GG+GC基因型和GCGGGT和GCGGAT单体型的HTPAP蛋白表达较+357CC和AGCTAC等其它单体型显著降低。(2)TagSNP+357 GG+GC基因型和GCGGGT纯合子或杂合子单体型是HCC术后无瘤生存差相关的独立因素,为HCC术后高复发风险的独立相关因子。