论文部分内容阅读
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是猪地方性肺炎(swine Enzootic Pneumnoia,SEP)的病原体。SEP亦称猪气喘病(Mycoplasma Pneumoniae of swine,MPS),广泛分布于世界各地,以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点。由于Mhp能够破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障而继发其他致病菌的感染,使死亡率大大提高,给养猪业造成巨大的经济损失。由于早期检测的困难和缺乏有效的药物,在疾病控制方面至今未能达到满意的效果。伴侣蛋白Dnak是猪Mhp的特异性外膜蛋白,该蛋白C端的是其主要的抗原决定簇。本研究依据GenBank中公布的Yin-1基因序列,以猪Mhp中国分离株Yin-1为模板,利用所合成的特异性引物,扩增DnaK基因的C末端,得到1 000bp的目的片段。将该序列克隆到pMD-18-T载体上,经PCR、酶切方法鉴定正确后测序,测序结果与GenBank公布的Yin-1标准株的DNA比较,二者同源性达99%以上。并将测序结果正确的片段分别克隆至表达载体pET-28a和pGEX-6P-1中,转化到大肠杆菌(DE3)中进行原核表达。将所获得的重组蛋白分别命名为6P-1-DnakC和28a-DnakC。经超声裂解,进行SDS-PAGE分析,表明重组蛋白均主要以可溶形式存在于上清液中,在42kD和65kD处分别获得特异性条带。Western-blot抗原性分析结果表明二者均具有较好的免疫原性。利用Histag亲和层析柱,对重组蛋白28a-DnakC进行分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE电泳分析,结果显示为单一蛋白条带,纯化效果较好。以6P-1-DnakC作为免疫抗原分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化,免疫8周龄的雌性BALB/C小鼠,每只每次500μg,间隔两周免疫一次,最后一次加强免疫不加佐剂,5d后取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。以纯化28a-DnakC作为包被抗原,用间接ELISA平行筛选阳性克隆,经有限稀释法三次亚克隆后,获得两株能稳定分泌特定性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1AD10和2AF11。生物学特性鉴定表明,腹水单抗1AD10、2AF11的间接ELISA效价分别为1:105和1:104,亚型鉴定分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为k链。相加ELISA试验表明,两株单抗识别不同的抗原表位。经Western-blot分析表明,两株单抗特异性的针对猪肺支原体Yin-1株65KD和42KD左右的抗原成分。而与其他相关支原体,如丝状支原体丝状亚种SC型标准株(PGI)、丝状支原体丝状亚种LC型标准株(Y-goat)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)、猪鼻支原体(Mh)无交叉反应,表明两株单抗为针对猪肺炎支原体的特异性单抗。本试验获得的抗Dnak单抗将为更深入地分析Mhp的结构、功能及生物学诊断提供有力工具。