研究背景与目的冠状动脉粥样硬化性心脏病是近年来发达国家主要的死亡原因之一,在发展中国家的发病率和死亡率也呈现明显升高趋势。抗凝、抗血小板聚集、调脂、稳定斑块是近年来针对缺血性心脏病的常规药物治疗措施,经皮介入血管重建术发展迅速和冠状动脉旁路移植术也是近年来的重要治疗手段,但同时都存在支架内及移植血管再狭窄、部分患者因病变弥漫不适合介入治疗的等问题,影响患者预后。在因血管狭窄或阻塞等病变导致组织器官缺血时,机体内相关促血管新生因子被激发而表达上调,促进缺血局部侧支循环的形成,但自身的这种代偿作用往往不完全或不及时。治疗性血管生成,通过外源性补充促血管生成因子(重组蛋白或基因)直接促进新生血管的生成,从而改善缺血组织的血液供应。近年来在缺血性实验动物的研究中所开展的治疗性血管新生主要是基因治疗和蛋白质治疗,二者对比,蛋白质治疗所需剂量大,效用维持时间短,一般需要反复使用,目前已很少被应用。基因治疗可在局部持续表达起作用,有可能仅需单次治疗就能达到预期的治疗效果。故而以基因转染技术来促进血管新生成为目前的研究重点。随着对血管生成机制的逐步研究,近年来发现了许多有促进血管生成能力的因子。最早被用于动物与临床研究的为VEGF(Vascular endothelial growth factor)与FGF(Fibroblast growth factor)。VEGF和FGF通过了I期临床试验,但II期临床试验的结果却不容乐观[1],发现VEGF可引起不成熟血管的生成、血管渗透性变大、组织水肿出现[2],FGF在促进新生血管形成的同时,部分实验患者出现了明显的蛋白尿。故而需要寻找新的促血管生成因子。血管新生是一个复杂的生物学过程,需要多种因子共同参与,依靠单一的促血管新生因子很难顺利完成。近年研究显示:HIF-1是一个非常重要的核转录因子,能直接或间接调控100多种下游靶基因[3,4],这些下游靶基因在血管生长、血管张力、红细胞生成、糖代谢、干细胞诱导分化等领域发挥重要作用[5]。HIF-1是由α和β两个亚基组成的异二聚体[6],以异源性二聚体的结构形式存在。HIF-1α是专一受O2调节的HIF-1亚单位,决定HIF-1的活性。在血管生成基因治疗领域,研究的重点是HIF-1α。到目前为止,已查明经HIF-1α直接调控参与血管新生的基因有30多种,是血管新生的上游核心调控因子[7-10]。HIF-1α结构域中含有氧依赖降解区(Oxygen Dependent Degradation Domain,ODDD),ODDD区Pro402以及Pro564的两个脯氨酸残基是否羟基化决定其蛋白稳定性[11]。HIF-1αC末端含有独立的转录激活区(C-Transactivation Domains,C-TAD)。C-TAD的Asn803是否被羟基化决定其蛋白转录活性[12]。常氧情况下,Pro402、Pro564和Asn803被羟化后,HIF-1α不稳定,在3-5分钟内被迅速降解,转录活性下降。低氧时,该过程受到抑制[13,14]。因此对ODDD区的402,564位点和TAD区的803位点进行联合突变,理论上可以最大程度地提高HIF-1α的稳定性和转录活性,从而达到满意的促血管生成作用的效果。我们的前期离体研究表明将HIF-1α关键功能区ODDD的Pro402、Pro564两个位点及TAD的Asn803联合突变构建的Ad-HIF-1α-Trip在常氧下能稳定存在,从而进一步促进对下游促血管生成因子的调控。本研究建立大鼠急性心肌梗死模型,采用肌肉注射的方式将以腺病毒为载体的HIF-1α突变体Ad-HIF-1α-Trip转染于大鼠缺血心肌局部,研究Ad-HIF-1α-Trip对大鼠缺血心肌的促血管生成作用及部分安全性。研究方法1.构建Ad-HIF-1α-402/564、Ad-HIF-1α-Trip,Ad-HIF-1α-402/564、Ad-HIF-1α-Trip在HEK293细胞中扩增,氯化铯密度梯度离心、透析纯化后滴度达到1.0×1011PFU/ml(本课题组先期构建)。2.建立急性大鼠心肌梗死模型150只,随机分成5组:Saline组、Ad-Null组、Ad-HIF-1α-402/564组、Ad-HIF-1α-Trip组、VEGF组,在缺血心肌通过肌肉注射方式进行基因转染。基因转染后7天、14天、21天,28天对大鼠行心脏彩超检查评价心功能,取大鼠心脏行病理切片、免疫组化CD31染色,观察血管新生情况;基因转染后28天处死大鼠,取心脏,行TTC染色检查,评估梗死面积。3.基因转染后1周抽取静脉血测定心肌酶、肌钙蛋白I、肝功能、肾功能、血常规。4.应用SPSS16.0统计软件进行数据分析。研究结果1.超声结果显示:基因转染后7天,LVEF、LVFS均表现为Ad-HIF-1α-Trip组>VEGF/Ad-HIF-1α-402/564>Saline组/Ad-Null组,随时间延长,各组指标均呈现随时间而下降的趋势,但Ad-HIF-1α-Trip组相对稳定,提示Ad-HIF-1α-Trip对心功能有保护作用,其它各组心功能均有不同程度的降低。2.基因转染后7天转染部位心肌组织免疫组化可见,CD31阳性细胞被染成棕黄色或棕色,散布于心肌梗死区及心肌梗死周边区,Ad-HIF-1α-Trip组表现最为明显。进行微血管密度计数(Microvessel density,MVD)计数,由高到低依次为:Ad-HIF-1α-Trip>VEGF组/Ad-HIF-1α-402/564>Ad-Null组>Saline组,One way ANOVA分析结果显示:组间对比差异有统计学意义(P<0.05)。两两对比结果显Ad-Null组与Saline组间,VEGF组与Ad-HIF-1α-402/564组间差异无统计学意义(P>0.05),余两两对比差异均有统计学意义(P<0.05)。基因转染后14天,Ad-HIF-1α-Trip组、VEGF组、Ad-HIF-1α-402/564组MVD明显减少,但仍多于Ad-Null组及Saline组,至基因转染后28天,5组MVD大致在同一水平。3.大鼠急性心肌梗死模型基因转染后7天,大鼠血常规和生化指标比较结果显示:各组大鼠白细胞计数均表现为略有增高,但组间差异无统计学意义(P>0.05),RBC、RBC、PLT、Hb、MCV、MCH计数均在正常范围,组间差异无统计学意义(P>0.05),c Tn I、CK、CK-MB浓度均高于正常值,由低至高均表现为Ad-HIF-1α-Trip组<VEGF组/Ad-HIF-1α-402/564组<Ad-Null组/Saline组,差异有统计学意义(P<0.05)。肝肾功能指标未见明显异常。4.HE染色结果显示:术后不同时间点,心、肝、肾、肺、脾、睾丸HE染色光镜下观察未见明显病理组织学改变。5.TTC染色结果示:术后28天,用TTC染色方法检测各组大鼠心肌梗死面积。Ad-Null组/Saline组>VEGF组/Ad-HIF-1α-402/564组>Ad-HIF-1α-Trip组,差异有统计学意义。研究结论1.Ad-HIF-1α-Trip可以促进心肌梗死大鼠缺血心肌血管生成、改善心脏功能。2.Ad-HIF-1α-Trip转染心肌梗死大鼠未对重要脏器功能产生明显不良影响,具有一定的安全性。