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研究背景和研究目的血栓闭塞性脉管炎(thromboangitis obilterans, TAO)是一种以中小动静脉慢性节段性病变为主的炎性闭塞性疾病,其主要侵袭四肢,尤其是下肢的中小动脉静脉,引起患肢远端缺血性病变。该病在各种族中均有发病,在欧洲它占到所有住院动脉闭塞性疾病的5%,而在日本则上升为16%。患者多为青壮年男性,绝大多数有吸烟史。其病程呈进展性,常表现为间歇性跛行、静息痛、溃疡及血栓性浅静脉炎等,患者生活质量受到严重影响,甚至面临截肢。已有研究显示血栓闭塞性脉管炎患者的动脉内膜中粘附因子血管内皮细胞粘附分子-1(VCAM-1)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、：选择素、肿瘤坏死因子α(TNF-a)表达明显增多,炎细胞浸润并且内膜明显增厚,因此将其定义为炎性疾病。尽管对其病因、病程进展、治疗等方面进行了大量研究,但关于血栓闭塞性脉管炎的机制仍然没有完全阐明,目前尚无有效治疗方法。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是为一种重要的炎症介质和致炎细胞因子当细胞活化或死亡时,HMGB1可被坏死或受损细胞被动释放至胞外,与其受体晚期糖基化终末产物受体(RAGE)(?)口/或TOLL样受体结合传递胞内信号并介导细胞反应,包括趋化细胞运动、释放促炎因子及粘附因子,它是启动和维持炎症瀑式反应的中心分子,HMGB1在多种炎症病理中作为一种信号传导和放大因素,可以增强炎症反应强度,延长炎症病理过程。目前发现在脓毒血症、急性胰腺炎及一些无菌性炎症包括关节炎、红斑狼疮、缺血再灌注损伤的患者血清及组织中HMGB1水平明显升高。同时已有研究表明HMGB1参与动脉粥样硬化、心肌梗死等多种心血管疾病并介导内皮细胞的损伤,HMGB1与内皮细胞共孵育能以时间依赖的方式增加ICAM-1、VCAM-1及RAGE勺表达,促使TNF-α、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、白细胞介素-6(IL-6)分泌,并可诱导内皮细胞释放纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)引起血小板变形。但HMGB1在血栓闭塞性脉管炎的作用目前未见报道。HMGB1自身有A和B两个DNA模体,结构功能分析显示其活化细胞因子的结构域定位在B盒子上,而A盒子竞争HMGB1的结合位点,减弱HMGB1全长的生物效应。现有研究表明HMGB1内源性抑制剂重组HMGB1A box (rA box)可以竞争性抑制HMGB1的促炎作用,在多种炎性动物模型中起到保护作用。鉴于血栓闭塞性脉管炎的炎性病变基础及HMGB1在介导炎症及内皮损伤过程中的重要性,本论文中我们通过建立大鼠血栓闭塞性脉管炎模型,研究了HMGB1与血栓闭塞性脉管炎的关系,探讨HMGB1内源性抑制剂重组HMGB1A box对于血栓闭塞性脉管炎大鼠的影响及相关分子机制,为明确血栓闭塞性脉管炎的发病机制和寻找有效治疗措施提供理论依据。研究内容1.建立大鼠血栓闭塞性脉管炎模型；2.研究HMGB1及其受体RAGE是否参与血栓闭塞性脉管炎发展；3.抑制HMGB1,能否抑制血栓闭塞性脉管炎病情进展；4.分析HMGB1参与血栓闭塞性脉管炎发展及其内源性抑制剂减缓血栓闭塞性脉管炎病情进展的相关机制。研究方法1.动物处理：股动脉注射月桂酸建立大鼠血栓闭塞性脉管炎模型,对照组注射等剂量的生理盐水,治疗组采用腹腔注射不同剂量重组HMGB1A box观察其疗效。2.大鼠患肢体征变化的观察：术后每日观察患肢的大体表现,术后15天参照日本学者Murakami提出的分级标准评级。4.收集组织：处理结束后,收集大鼠股动脉、血液备用。5.组织形态学分析：苏木精-伊红染色,观察管壁结构及血管通畅性,计算血管腔内血栓面积。6.血液学检测：收集大鼠血液行血细胞计数及凝血指标检测。7.血浆中蛋白水平的分析：利用试剂盒检测血浆中HMGB1、血栓素B2(TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-K-PGF1α)蛋白水平。8.股动脉中蛋白水平的分析：1)用免疫组织化学法结合激光扫描共聚焦显微术,检测HMGB1及其受体晚期糖基化终末产物受体(RAGE)在血管壁中蛋白表达水平及分布。2)用VVestern blot方法,检测蛋白的表达水平。9.股动脉中炎性因子及粘附因子蛋白水平的分析：1)用免疫组织化学法,检测炎性因子白介素-6(IL-6)、粘附因子血管内皮细胞粘附分子-1(VCAM-1)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的蛋白表达水平及分布。2)用Western blot方法,检测蛋白的表达水平。10.股动脉中基因水平的分析：利用实时荧光定量PCR术,检测动脉中HMGB1、 RAGE、IL-6、VCAM-1、ICAM-1的(?)mRNA水平。研究结果：1.利用股动脉注射月桂酸法成功建立大鼠血栓闭塞性脉管炎模型1.1注射月桂酸15天后,模型组大鼠呈现血栓闭塞性脉管炎的典型症状和体征。1.2HE染色显示：动脉壁炎细胞浸润,腔内血栓形成,管腔狭窄几近闭塞。2. HMGB1及其受体RAGE参与了血栓闭塞性脉管炎的发展2.1我们检测了各组动物血浆中HMGB1蛋白变化。模型组血浆中HMGB1的蛋白水平较正常组及假手术组明显升高(p<0.01),正常组及假手术组之间没有显著差异。2.2对各组动物股动脉组织切片进行免疫组织化学染色和双染免疫荧光染色发现：模型组中HMGB1主要在内膜及中膜的胞质中表达,其受体RAGE主要主要在内膜中表达。模型组股动脉中HMGB1及其受体RAGE的蛋白水平较正常组及假手术组明显升高。2.3对各组动物股动脉组织进行Western Blot和PCR分析发现：模型组股动脉中HMGB1及其受体RAGE的蛋白及rnRNA水平较正常组及假手术组明显升高(p<0.01)3.抑制HMGB1能够抑制血栓闭塞性脉管炎病情进展3.1处理结束后对各组大鼠根据Murakami分级标准评级结果显示模型组病变等级较假手术组明显升高,腹腔注射低剂量及高剂量重组HMGB1A box均明显降低血栓闭塞性脉管炎病变等级。3.2HE染色显示：低剂量重组HMGB1A box减低,高剂量重组HMGB1A box明显降低血栓闭塞性脉管炎模型中股动脉血栓面积(p<0.05)。3.3ELISA结果显示：低剂量重组HMGB1A box抑制血浆中HMGB1表达。高剂量重组HMGB1A box显著降低血浆中HMGB1表达(p<0.05)。3.4处理各组动物股动脉组织进行免疫组织化学染色、双染免疫荧光染色、Western Blot和PCR结果显示：低剂量重组HMGB1A box抑制血管壁中HMGB1、RAGE蛋白及mRNA表达水平。高剂量重组HMGB1A box显著抑制血管壁中HMGB1、RAGE蛋白及mRNA表达水平。上述实验结果证明重组HMGB1A box通过抑制HMGB1及RAGE表达减缓病情进展并呈剂量依赖性。4. HMGB1参与血栓闭塞性脉管炎病情发展及重组HMGB1A box保护机制的研究4.1模型建立成功后,我们对各组动物股动脉组织切片进行免疫组织化学染色发现：模型组血管壁中炎性因子IL-6、粘附因子,VCAM-1和ICAM-1(?)的蛋白水平较正常组及假手术组明显升高(p<0.05),正常组及假手术组之间无明显差异。4.2股动脉组织进行Western Blot和PCR分析发现：模型组股动脉中炎性因子IL-6、粘附因子VCAM-1和ICAM-1的蛋白及mRNA (?)<平较正常组及假手术组明显升高(p<0.05)。4.3应用低剂量及高剂量重组HMGB1A box腹腔注射后,免疫组织化学染色,Western Blot及PCR检测结果显示高剂量重组HMGB1A box显著抑制血管壁中炎性因子IL-6、粘附因子VCAM-1和1CAM-1蛋白及mRNA表达水平(p<0.05)。4.4在血液学检查中我们发现模型组中血小板计数(PLT)及纤维蛋白原(FIB)较正常组及假手术组明显升高(p<0.05)。凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)较正常组及假手术组明显降低(p<0.05)。而红细胞计数、白细胞计数、中性粒细胞计数在各组中未见明显变化。4.5应用重组HMGB1A box处理后,高剂量处理组血小板计数(PLT)及纤维蛋白原(FIB)较模型组明显降低(p<0.05)。凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)较模型组明显升高(p<0.05)。低剂量重组HMGB1A box起到相同的作用,但效果较弱。4.6血栓素B2(TXB2).6-酮-前列腺素F1α(6-K-PGF1α)分别是血栓素A2(TXA2)和前列环素(PGI2)的稳定代谢产物,两者分别诱导和抑制血小板聚集。对各组动物血浆行ELISA检测发现：模型组血浆中6-K-PGF1α较正常组及假手术组明显降低(p<0.05)；而TXB2及TXB2/6-K-PGF1α明显升高(p<0.05)。在应用低剂量和高剂量重组HMGB1A box处理后血浆中6-K-PGF1α水平明显升高(p<0.05)；TXB2及TXB2/6-K-PGF1α明显降低(p<0.05)。结论：1. HMGB1及其受体RAGE参与月桂酸诱导的大鼠血栓闭塞性脉管炎模型中。2. HMGB1抑制剂重组HMGB1A box能够抑制血栓闭塞性脉管炎病情进展。3.重组HMGB1A box通过抑制HMGB1及其受体RAGE (?)的表达,从而抑制炎性介质的释放及损伤作用并改善凝血状态。