论文部分内容阅读
Kisspeptin通过结合促性腺激素释放激素(GnRH)神经元上的Kiss1R从而调节脊椎动物的生殖活动。扬子鳄为我国特有的珍稀爬行动物,有关生殖调控机理尚不清楚。本文通过cDNA末端快速克隆、免疫组织化学、实时荧光定量PCR、双荧光素酶报告基因系统检测等方法,对扬子鳄kiss1/kiss1R系统以及大脑垂体性腺轴(BPG)相关激素的表达和功能进行了研究,其结果将有助于扩展对爬行类kiss1/kiss1R系统调控BPG轴机理的了解。主要结论如下:1、通过cDNA末端快速克隆技术,首次同源克隆出扬子鳄的kiss1,kiss1R和GnRH1基因cDNA序列全长,以及扬子鳄kiss1R基因的启动子序列,并对他们编码的氨基酸序列的特征进行分析。同时,这也是首次在爬行动物中获得kiss1和kiss1R cDNA全长序列。1)扬子鳄kiss1 cDNA长为816bp,包括一个不完整的5’非编码区(5’UTR;4bp),一个完整的开放阅读框(ORF;417 bp)以及一个完整的3’非编码区(3’UTR;395 bp)。ORF区可以编码一个前体蛋白,有138个氨基酸,预测信号肽区域为前19个氨基酸。该蛋白的分子量为15.535 kDa,等电点为10.33。2)扬子鳄kiss1R cDNA长为2348 bp,包含一个部分的5’UTR(109 bp),一个完整的3’UTR(1153 bp)和一个完整的ORF区(1086 bp)。其ORF区可以编码一个前体蛋白,有361个氨基酸。该蛋白的分子量约为40.126 kDa,等电点为9.51。3)扬子鳄GnRH1 cDNA长为776 bp,包含一个部分的5’UTR(68 bp),一个完整的ORF区(282 bp)和一个完整的3’UTR(426 bp)。ORF区可以编码一个前体蛋白,有93个氨基酸,预测信号肽区域为前23个氨基酸。该蛋白的分子量约为10.356 kDa,等电点为6.09。4)获得扬子鳄kiss1R启动子序列长为2604 bp,与其他鳄目动物的相应序列高度同源。同时,还发现4个预测的启动子区域,以及TATA box,CAT box,GC box等和一些潜在的转录因子结合位点,例如Sp1、C/EBP、YY1和一些类固醇激素受体的结合位点。这些推测的结合位点的存在可能预示着这些转录因子对kiss1R的分泌和表达起到重要的调控作用。对得到的氨基酸序列进行了生物信息学和系统进化分析。多重序列比对分析后发现这些预测的氨基酸序列与其他鳄目动物的序列同源性很高,说明鳄目动物的kiss1、kiss1R和GnRH1基因在进化上是保守的。此外,kiss1中的kiss1-10序列、kiss1R中的7个跨膜结构域序列以及GnRH1中的GnRH1-10序列在脊椎动物进化中也是高度保守的。构建脊椎动物kiss1、kiss1R和GnRH1氨基酸序列系统发生树,所有的鳄目动物先聚为一支后再与龟鳖目动物聚在一起。说明在爬行类中,鳄目与龟鳖目的进化关系较近。2、利用免疫组织化学方法对扬子鳄kiss1蛋白在各组织中以及类固醇激素受体(ESR1、ESR2、AR和PR)蛋白在脑组织中的表达进行定位分析。结果表明kiss1蛋白和类固醇激素受体蛋白广泛的表达在各个组织中,并且这些蛋白在脑组织中具有共同的分布区域,这说明在扬子鳄中,类固醇激素可能通过脑中的同源受体对kiss1/kiss1R系统进行反馈调节。3、利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术对扬子鳄kiss1/kiss1R基因以及BPG轴相关基因(GnRH1、GnRH2、ESR1、ESR2、AR、PR)在不同组织和生殖周期中的时空表达进行分析。结果发现,除GnRH2基因只表达在脑和垂体中之外,其他检测的基因都广泛表达在各个组织中,不过这些基因在脑、垂体、性腺和肝脏等与生殖相关的组织中表达量高。在雌性扬子鳄生殖周期不同阶段的下丘脑、垂体和卵巢中,这些基因的表达水平发生显著变化,这可能说明这些基因参与到雌性扬子鳄繁殖和卵巢发育的过程。4、利用全基因合成的方法合成扬子鳄kiss1R基因ORF区全长序列,并成功构建含扬子鳄kiss1R基因编码区全长的双荧光素酶表达载体。通过双荧光素酶报告系统检测不同合成的激素研究扬子鳄kiss1R在HEK293细胞中的表达活性变化。结果表明雌二醇和所有合成的kiss1-10肽都显著的提高kiss1R的转录活性并主要通过激活蛋白激酶C(PKC)信号转导通路来发挥作用。此外,合成的各种kiss1-10肽刺激扬子鳄kiss1R表达具有不同的效能,表明配体选择性的差异。这些数据在爬行类动物中是首次报道,确定了扬子鳄kiss1R的信号转导通路和配体选择性,为未来研究其他爬行动物的kiss1/kiss1R系统奠定基础,也扩大我们对kiss1和kiss1R对的分子共同进化的认知。综上所述,在扬子鳄中,kiss1/kiss1R系统可能在脑、垂体和性腺中调节生殖相关的活动,同时,性类固醇激素也可能通过其同源受体在脑和垂体中对kiss1/kiss1R系统进行反馈调节,雌二醇和所有合成的kiss1-10肽主要通过激活PKC信号转导通路来发挥作用。