【摘 要】
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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是一种常见的人兽共患条件致病菌。该菌对家禽和家畜等多种动物均有致病性,同时是医院内最常见的病原菌之一,常导致病人的高死亡率,具有重要的公共卫生意义。几乎从所有动物中都分离到了致病性PA,其中以禽源PA的分离率最高。目前,随着养禽业规模的不断扩大,由PA引起的疫病呈不断上升趋势,给养禽业造成危害,而目前对禽源PA的流行情况和耐药数据了
【基金项目】
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广东省家禽产业技术体系疾病控制岗位专家（2018LM1114）； 国家肉鸡产业技术体系岗位科学家（CARS-41-G16）；
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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是一种常见的人兽共患条件致病菌。该菌对家禽和家畜等多种动物均有致病性,同时是医院内最常见的病原菌之一,常导致病人的高死亡率,具有重要的公共卫生意义。几乎从所有动物中都分离到了致病性PA,其中以禽源PA的分离率最高。目前,随着养禽业规模的不断扩大,由PA引起的疫病呈不断上升趋势,给养禽业造成危害,而目前对禽源PA的流行情况和耐药数据了解较少,所以开展种禽场PA的流行病学研究具有重要意义。为了掌握广东省种禽场PA的流行特点和耐药情况,本研究在2018年3月至2019年1月期间,从广东省不同地区采集种禽死胚及其周围环境样本共1224份,分离到PA共233株（分离率19.04%）,其中环境样本37株（19.17%）,死胚196株（19.01%）,包括鸡75株（11.45%）、七彩山鸡109株（34.28%）、鹅12株（30%）。基于22种常用抗菌药的药物敏感性分析显示,233株PA对复方新诺明、四环素、氯霉素的耐药性较强,耐药率分别为99.1%、77.3%、76.0%,其次为头孢噻肟（16.3%）,其中多重耐药的PA占比达67.4%,并且出现了对亚胺培南、哌拉西林、头孢吡肟和阿米卡星等医院临床抗感染的高级药物耐药的菌株;对233株PA的27种耐药基因进行PCR检测,共有22种耐药基因检测为阳性,碳青霉烯类的opr D2检出率最高（29.18%）,氟喹诺酮类耐药基因以qnr D（11.59%）为主,与表型耐药率一致;氨基糖苷类耐药基因检出率最高的为aac（3）-II和ant（3’’）-I,均为10.73%;氯霉素类耐药基因以cml A（16.31%）为主,四环素类耐药基因检出率最高为tet A（10.30%）,磺胺类的qac E△1-sul1检出率为13.73%;5种常见金属β-内酰胺酶类耐药基因（VIM、IMP、SPM、GIM、NDM）检测结果均为阴性。从各个地区中选取耐药谱较广的118株PA,进行MLST分型,结果显示,118株菌可分为28个ST型,呈现出高度多样性,其中ST-260型占比最多,其次为ST-2100和ST-3202型,并且有9个ST型是本研究新发现的,表明其进化速度较快;最小生成树显示,28个ST型仅包含3个克隆复合体,环境和死胚中的PA表现出较近的亲缘关系,其余ST型呈分散分布;结合ST型和耐药谱分析结果表明,同一ST型或相似的克隆群的耐药谱并不一定相同。鉴于PA是一种重要的人兽共患病原菌,且目前PA的检测方法都存在各自的不足,因此建立了一种简便、准确、快速的分子检测方法,为由PA感染所致疾病的诊断提供技术支撑。本研究采用交叉引物恒温扩增技术原理,根据PA的特异性基因opr I,设计1组带有FAM和Biotin标记的交叉扩增引物组,配套使用核酸检测试纸条,建立了可视化的PA交叉引物恒温扩增检测方法（PA-CPA）,在62℃恒温扩增45 min即可,其灵敏度是常规PCR的100倍,用建立的PA-CPA方法检测83份临床样本中的PA,同时与细菌的分离培养及常规PCR方法进行比较,结果显示PA-CPA方法的灵敏度最高。该方法不需要PCR仪,仅一台水浴锅或金属浴即可完成DNA的扩增,使用密闭的核酸检测装置使结果判定直观、客观,且可有效避免气溶胶污染,可应用于PA的快速检测。综上所述,本研究所调查的广东省11个种禽场,不仅其死胚中存在不同程度的PA感染,而且其周围环境中也存在相当比例的PA污染,这些菌株还表现出较强的耐药性,不容忽视,且环境和死胚中的PA表现出较近的亲缘关系。因此建议种禽场在养殖过程中一方面要加强饲养管理,及时对种蛋、孵化机及其周边环境进行清洁和消毒;另一方面应根据药敏试验结果合理使用抗菌药,以尽量减少多重耐药菌株的出现。本研究建立的PA-CPA检测方法,具有应用于PA现场快速检测的潜力,为由PA感染所致疾病的诊断和防治提供了技术支撑。
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