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由于环境污染,石油供应短缺等全球性问题日趋严重,人们迫切的需要一种绿色的可再生资源替代传统的化石燃料。生物柴油因具有绿色环保,原材料来源广泛等优点而备受关注。以微藻为原料制备生物柴油具有光合利用效率高,生物量大,培养成本低,不占用耕地面积等诸多优势。三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是一种海洋单细胞硅藻,含油量能够达到自身干重的20%~30%。目前三角褐指藻的全基因组测序工作已经完成,其细胞核的遗传转化体系也已确立,是研究微藻油脂代谢的良好模式生物。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是植物体内调控脂质和蛋白质合成的关键酶。如PEPC酶的活性受到抑制,则植物体内脂质合成增加,蛋白质合成减少;而当PEPC酶的活性提高,则植物体内脂质合成减少,蛋白质合成增加。在微藻中如蓝藻,莱茵衣藻等,曾报道PEPC酶具有类似的调控作用。因此,控制PEPC酶活性可以调控生物体内油脂和蛋白质的合成。三角褐指藻中具有两种PEPC酶,PEPC1和PEPC2,分别由基因pepc1及pepc2编码。本实验根据NCBI上公布的三角褐指藻pepc1及pepc2的基因序列,分别设计了反义表达载体,使用基因枪方法转化野生型三角褐指藻。通过绘制生长曲线检测转基因藻的比生长速率,GC-MS方法检测转基因藻的脂肪酸组成和含量,Real-Time PCR方法检测转基因藻内pepc1(pepc2)的相对表达水平,从而研究pepc1(pepc2)基因的抑制对三角褐指藻油脂含量的影响。具体研究结果如下:1.分别克隆并构建了三角褐指藻pepc1基因的启动子前序列(P1-1),5’端翻译起始序列(P1-2),3’端TAA前序列(P1-3),中间编码序列(P1-4)及pepc2基因的启动子前序列(P2-1),5’端翻译起始序列(P2-2),跨内含子序列(P2-3),3’端TAA前序列(P2-4),中间编码序列(P2-5)的反义表达载体(P1-1/Bar等9个),经过筛选得到了P1-2/Bar、P1-3/Bar、P1-4/Bar、P2-2/Bar、P2-3/Bar、P2-5/Bar共6个载体质粒的转基因藻。2.经过生长曲线及比生长速率分析,培养期内各转基因藻株间比生长速率差异性较大。pepc1转基因藻的比生长速率为野生型的77.43%~122.77%,部分藻株呈显著降低(或升高);pepc2转基因藻株比生长速率为野生型的75.03%~114.70%,部分藻株呈显著降低(或升高)。3.荧光定量PCR结果表明,与对照组相比转基因藻的m RNA相对转录水平有不同程度降低。pepc1转基因藻株m RNA相对转录水平降低了1.36%~48.58%,其中最低的为导入了P1-4/Bar重组质粒的转基因藻株;pepc2转基因藻株相对转录水平降低了12.80%~57.93%,其中最低的为导入了P2-2/Bar重组质粒的转基因藻株。4.脂肪酸分析结果显示,与对照组相比各转基因藻的油脂含量差异显著。pepc1的转基因藻总脂增加了2.67%~74.98%,其中总脂含量最高为导入了P1-4/Bar重组质粒的转基因藻株;pepc2的转基因藻总脂增加了5.51%~108.34%,其中总脂含量最高为导入了P2-2/Bar重组质粒的转基因藻株。部分转基因藻株油脂含量显著低于野生型。脂肪酸组分以C14:0、C16:0、C16:1、C16:2、C20:5为主,含量最高为C16:1。饱和脂肪酸相对含量达24.60%~35.80%,不饱和脂肪酸相对含量达64.2%~75.40%。C16:0~C18:0相对含量达62.84%~83.12%。转基因藻株生物柴油品质指标不同时符合全部标准。本实验通过转化pepc1及pepc2基因不同序列的反义表达载体,分别抑制三角褐指藻中pepc1和pepc2基因的表达,得到油脂含量显著提高的转基因藻株。实验结果为使用基因工程手段改造三角褐指藻制备生物柴油提供实验依据。