[目的]随着生命科学的发展,再生医学近年来成为临床和科研人员研究热点。构建组织工程骨修复骨缺损时,迅速血管化是核心问题。血管内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)是干细胞分支,理论上可以促进血管化,同时可为种子细胞提供营养支持。EPCs独特的生理特性,为组织工程骨修复骨缺损的治疗带来了新思路。课题组前期工作表明骨髓间充质干细胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)和 EPCs 联合培养构建脱蛋白生物骨(partially deproteinized biological bone,PDPB)形成生物骨,在活体动物模型内的微血管化状态良好,具有促进脱蛋白生物骨上细胞的增殖和体内成骨生长等作用。本研究应用Transwell小室体外构建BMSCs和EPCs间接共培养体系,精确定量分析复合培养体系中EPCs对BMSCs生长增殖、多向分化能力。通过建立实验动物模型在骨缺损体内观察EPCs对BMSCs归巢能力影响;后期通过mRNA基因芯片筛选复合培养体系差异基因表达,分析可能涉及的基因,推测复合培养体系中EPCs调节BMSCs生物学行为机制,为BMSCs构建组织工程骨修复缺损提供新的理论依据及临床应用方法。[方法](1)取12周龄兔骨髓血,根据BMSCs贴壁生长特点进行纯化,使用显微镜观察并记录细胞形态改变。将BMSCs传代至该细胞的第3代,使用流式细胞仪对CD29、CD34、CD45表面抗原的表达进行检测,对BMSCs表型进行鉴定。(2)取12周龄兔外周血,按EPCs差速贴壁特性纯化EPCs,取第三代形态规则的细胞分别用Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acetylated Low Density Lipoprotein,Dil-acLDL)和荧光素标记的荆豆凝集素-1(Fluorescein Ulex Europaeus Agglutinin-1,FITC-UEA-1)进行双重染色。在相差显微镜下观察细胞形态变化和在体外形成特有的管腔结构;在荧光显微镜下观察双标染色结果。(3)将不同比例EPCs和BMSCs分别置于Transwell小室上室和下室,通过细胞计数的方法筛选双细胞体外最佳共培养比例。(4)取市售猪尾椎骨制作脱蛋白生物骨(partially deproteinized bone,PDPB)。应用Corning公司的Transwell小室构建BMSCs和EPCs间接复合培养体系。收集EPCs控制其密度为1×105/mL接种于Transwell上室底膜上,最佳比例BMSCs接种于下室。相同数量BMSCs单独培养于6孔板内作对照组。将PDPB置于两组BMSCs细胞悬液中,加入基础培养基连续培养7天,隔天换液。。(5)通过细胞计数连续记录10天BMSCs数量,绘出两组BMSCs的生长曲线。(6)分别对Transwell小室中BMSCs和单独培养的BMSCs作成骨诱导。在第1、3、7、14天时检测碱性磷酸酶活性;1、3、7、14、21天时检测骨钙素分泌量;制作细胞爬片进行茜素红染色并分析。分别对Transwell小室中BMSCs和单独培养的BMSCs作成脂诱导。制作细胞爬片进行油红O染色并分析。(7)将复合细胞-生物骨置于制作的活体骨缺损模型内,免疫组化方法检测各组在第2、4、8周eGFP阳性染色率。(8)第8周时通过实时定量PCR检测基质细胞衍生因子(endogenous stromal-derived factor-1,SDF-1)及其趋化因子受体CXCR4、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)及其趋化因子受体 CCR2 mRNA 表达水平,ELISA检测各组SDF-1和MCP-1蛋白分泌量,Western blot检测各组CXCR4和CCR2蛋白表达量。(9)将置入体内各组的组织工程骨制成切片,在2、4、8周时通过组织学(Masson)染色,以像素(pixels)代表骨面积进行计算比较各组成骨能力。(10)制备mRNA芯片样本,收集Transwell小室第14天时的上下两室细胞,Trizol提取总RNA后使用北京博奥晶典生物技术有限公司Affymetrix表达谱芯片检测复合细胞培养组中细胞和单独细胞培养组细胞差异基因的表达,筛选作用通路、推测EPCs对BMSCs可能的调控机制。[结果](1)BMSCs原代培养至第三代时可见培养瓶底细胞类梭形聚集生长。EPCs培养至第三代时,贴壁细胞明显增多,呈松散排列的铺路石状。通过流式细胞仪检测BMSCs表面标志物CD29阳性率达到97.1%,CD34、CD45为阴性,符合BMSCs特征。Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和荧光素标记的荆豆凝集素免疫荧光双标染色阳性,符合EPCs可同时摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和荧光素标记的荆豆凝集素的特点且在体外Matrigel胶上培养24h后可形成特有的管腔样结构,符合EPCs特征。(2)将EPCs和BMSCs以不同比例进行体外共培养,观察各组BMSCs增殖率,以EPCs:BMSCs在10:1时为最佳比例组。(3)课题组制备的脱蛋白生物骨(partially deproteinized biological bone,PDPB)电镜下呈光滑的多孔样结构。用蒸馏水清洗后未见漂浮物。7天后,将细胞种植于生物骨于扫描电镜下观察,可见细胞附着于PDPB表面,生成大量纤维丝。细胞和PDPB连接紧密。(4)两组细胞生长曲线描绘总趋势呈复合细胞培养组BMSCs增殖活性高于BMSCs单独培养组。BMSCs经成骨诱导后,碱性磷酸酶检测结果显示BMSCs单独培养组在11天后出现碱性磷酸酶活性降低,而复合细胞培养组在14天碱性磷酸酶才逐渐降低。ELISA结果示第1天时两组BMSCs分泌骨钙素量无显著性差异,从第3天后复合细胞培养组细胞分泌骨钙素量显著高于BMSCs单独培养组。(5)BMSCs通过成脂诱导可形成脂肪滴,细胞形态发生改变,逐渐从梭形转为圆形、椭圆形等。加诱导液后第48h时复合细胞培养组和BMSCs单独培养组出现脂滴泡,经油红O染色脂质沉积的定量分析发现7天后复合细胞培养组脂滴茜素红吸光度显著高于BMSCs单独培养组吸光度。(6)免疫组化染色结果提示在第2周时eGFP阳性染色率各组间无显著性差异;4周后复合细胞培养组的eGFP阳性染色率显著高于骨髓间充质干细胞单独培养组、血管内皮祖细胞单独培养组和未种植细胞组。(7)在第8周时,基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor,SDF-1)mRNA在复合细胞培养组的表达显著高于骨髓间充质干细胞单独培养组,血管内皮祖细胞单独培养组和未种植细胞组。而其受体CXCR4的在复合培养组的表达同样高于其他各组。单核细胞趋化蛋白 1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-l)mRNAs 在复合培养组的表达高于其它各组,然而,MCP-1受体CCR2在复合细胞培养组的表达与其它各组相比无显著性差异。(8)在第8周时,SDF-1在复合培养组的分泌量显著高于其它各组;而MCP-1在复合培养组的蛋白表达仅高于未种植细胞组;CXCR4在复合培养组的表达高于其它各组;复合培养组的MCP-1受体CCR2蛋白水平与其他各组表达无显著性差异。(9)复合培养组的新生胶原量在2周时高于血管内皮祖细胞单独培养组和未种植细胞组,从第4周后复合培养组的新生胶原量显著高于骨髓间充质干细胞单独培养组,血管内皮祖细胞单独培养组和未种植细胞组。(10)以复合细胞体系组/单独细胞培养组>2上调基因,<0.5为下调基因为标准,芯片结果显示:复合细胞体系中BMSCs与单独培养的BMSCs相比,差异表达的基因共1772个,其中表达上调共664个,下调共1108个;显著富集基因的名称:染色体,着丝点区域,细胞内无膜细胞器,DNA包装器等;显著富集的通路名称:细胞周期,p53信号通路,酮体代谢,癌症的转录信息系统等。(11)复合细胞体系中EPCs与单独培养的EPCs相比,差异表达的基因共1473个,其中表达上调共595个,下调共878个;显著富集基因的名称:胞内细胞器,有丝分裂的细胞进程,染色体等;显著富集的通路名称:细胞周期,DNA复制,p53信号通路,癌症的转录信息系统,嘌呤代谢等。[结论](1)采用贴壁法分离、纯化兔BMSCs和EPCs的方法可靠有效。经流式细胞仪鉴定BMSCs符合骨髓来源干细胞表面标记特性,纯度较高;经免疫双标的方法鉴定EPCs染色效果明显,双标颜色符合EPCs特征,可行后续实验。(2)将筛选出的最佳细胞增殖比例种植于Transwell小室的上室和下室,细胞培养技术采用含有生物半透膜的插入式培养皿与6孔板建立起联合培养方案装置可成功构建BMSCs和EPCs体外间接共培养体系。(3)原代培养的兔BMSCs经成骨、成脂诱导液培养,可向成骨细胞、脂肪细胞分化并表现出各自分化特征。(4)通过构建复合细胞体系和对照组可有效比较复合细胞组和单独培养组中BMSCs的生物学差异,复合细胞组中的BMSCs表现出更强的细胞增殖活性、更有潜力的成骨、成脂分化能力。(5)eGFP阳性染色率免疫组化染色结果提示复合细胞培养组具有更强的促进外源性BMSCs向缺损处归巢的作用。(6)SDF-1/CXCR4和MCP-1/CCR2两条趋化轴与血管内皮祖细胞促进骨髓间充质干细胞趋化运动密切相关。其中以SDF-1/CXCR4轴联系更明显。(7)BMSCs和EPCs与课题组制备的脱蛋白生物骨复合后可更有效、更快速的进行骨缺损修复。(8)采用Transwell小室构建的BMSCs和EPCs间接共培养体系,与BMSCs单独培养组、EPCs单独培养组各自作为对照制作mRNA芯片样本,可有效筛选出的复合培养组和对照组差异表达的基因,从而为下一步研究兔BMSCs和外周血EPCs相互作用机理、探索可能的作用机制奠定基础。