高山被孢霉产花生四烯酸发酵育种、调控及遗传背景研究

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高山被孢霉为接合菌纲被孢霉科被孢霉属,是一种丝状真菌,因其具有花生四烯酸(ARA、AA)含量高、多不饱和脂肪酸(PUFAs)种类合理、ARA分离纯化简单、菌种安全性高等特点,被认为是ARA良好的微生物来源发酵菌,现已被广泛应用于工业生产。  为进一步提高高山被孢霉ARA产量,本文尝试了多种诱变选育方法,即离子束注入诱变、磁场及Fe2+共同诱变、自然杂交等,最终得到一株高产ARA的高山被孢霉菌株,其发酵产物中油脂含量为15.56g/L,最终ARA得率为6.56g/L,遗传稳定性良好。  本课题对高山被孢霉高产菌种的遗传背景进行了初步研究,目标是对高产菌种的特异基因序列进行识别,进而建立分子遗传保护手段,并为未来使用基因工程手段定向选育高产菌奠定理论基础。针对因高山被孢霉细胞壁中几丁质含量较高导致的破壁困难问题以及菌株在不同条件下表现出的基因组质量不同,本文通过优化菌丝破壁处理方法及菌株培养方式最终确定了获取高山被孢霉转录组及基因组的最佳方式。对筛选所得新一代高山被孢霉高产菌株Z J-3进行ITS鉴定以及全基因组测序,对其特有的遗传位点进行标记,建立分子遗传学保护手段。对诱变获得的高产菌株J-3进行高通量测序及ITS鉴定的结果表明,高效菌株J-3鉴定为高山被孢霉,通过对数据库高山被孢霉菌株与诱变菌株J-3进行High-seq二代测序,最终确定了5个相关变异点。为未来使用基因工程手段定向改造高山被孢霉奠定理论基础。  本课题对高山被孢霉发酵培养基进行优化调整,分别对碳源、有机氮源、无机氮源及多种生长因子的添加方式进行了研究。在碳源优化研究中,考查多种单一碳源和复合碳源对高山被孢霉产ARA的影响,结果表明摇瓶发酵时葡萄糖是最佳的单一碳源,葡萄糖与甘油以质量比4∶1混合则是最佳的复合碳源,使用复合碳源发酵产ARA产量比单一葡萄糖碳源提高了18.6%。在尝试以无机盐及多种生长因子代替酵母粉提供氮源的研究中发现,酵母粉作为迟效氮源仍最有利于高山被孢霉的生长及油脂积累,并能获得较高的ARA产量。以无机盐及生长因子作为氮源虽目前尚不能满足工业发酵的需求,但其优势是全合成培养基成分简单及含量稳定,可避免工业生产中因酵母粉生产批次不同而导致ARA产量的不稳定现象,该项研究将为未来全合成培养基代替传统培养基的研究奠定基础。另外,论文通过响应面分析法确定了发酵培养基中多因素间的交互作用,对未来在工业生产中的应用奠定基础。
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