研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一个以血管内皮细胞损伤、血脂代谢异常为基础、以血管慢性炎症为特征的病理过程,可引发心肌梗死、脑梗死等严重危害人类健康和生命的疾病。从内皮功能损伤到动脉粥样斑块形成以及斑块不稳定破裂,血脂异常、氧化应激和炎症在整个动脉粥样硬化发生发展过程中均具有重要作用。氧化应激促使低密度脂蛋白(LDL)被氧化修饰,而且造成血管内皮细胞损伤,进一步激活炎性因子表达释放,炎性反应增加,促进AS斑块形成和进展。因此,抗炎抗氧化和降低胆固醇水平一样,在抗动脉粥样硬化过程中具有重要意义。研究已证实高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)除具有促胆固醇逆转运的作用外,还有抗炎抗氧化的功能,改善HDL抗炎抗氧化功能对于延缓动脉粥样硬化进展具有重要意义。屏氧化酶(paraoxonase1, PON1)是HDL上的重要抗氧化酶,抑制LDL被氧化修饰、脂质过氧化物堆积,从而发挥抗AS作用。髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)是一种强致氧化性酶,可损害HDL的促胆固醇逆转运功能和抗炎、抗氧化功能,使HDL由抗炎转为致炎状态。载脂蛋白AI(apolipoprotein A-I, apoA-I)是HDL的主要蛋白成分,约占蛋白质含量的70%,在促胆固醇逆转运过程(reverse cholesterol transport, RCT)中发挥关键的作用,还有抗炎、抗氧化、抗血栓形成、内皮保护功能。HDL炎症指数(high-density lipoprotein inflammatory index, HII)是反映HDL抗炎/促炎功能状态的一个重要指标。与单纯升高HDL-C浓度相比,改善HDL抗炎功能对于抑制动脉粥样硬化发生和进展更具有意义。目前临床上对于动脉粥样硬化的治疗,最常用的药物是他汀类调脂药,主要作用靶点在于降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平,其可通过降低LDL-C含量而降低心血管事件,也有轻度升高HDL-C水平的作用,但临床上长期应用他汀类药物治疗的病人仍有相当高的冠心病发病或复发的风险。而HDL被认为是脂质代谢过程中具有抗AS作用的脂蛋白,其作为目前新型调脂药物的干预靶点,已日渐受到重视。HDL功能较其含量更为重要这一观点也得到了大家的认同。ApoA-I模拟肽(apoA-I mimetic peptide) L-4F是一种人工合成的由18个L-氨基酸组成的肽类,具有与apoA-I类似的脂质结合能力。L-4F虽不升高HDL-C水平,但其可促进促胆固醇逆转运、减轻AS程度、抑制炎症因子分泌及改善高脂血症患者的血管舒张功能等。因此我们选用以降低LDL-C水平为主要作用靶点的他汀类药物辛伐他汀,联合以改善HDL功能为主要作用目标的apoA-I模拟肽L-4F,观察两种药物联用对apoE缺失小鼠血脂、血清PON1活性、MPO活性和HDL炎症指数等HDL抗炎抗氧化功能相关指标以及动脉粥样硬化的影响,探讨两药联用延缓动脉粥样硬化的可能机制。研究目的本研究采用高脂饮食喂养apoE基因缺失小鼠构建动脉粥样硬化模型,观察比较辛伐他汀、apoA-I模拟肽L-4F及两药联用对HDL抗炎抗氧化功能及延缓动脉粥样硬化进展的影响,探索通过联合降低LDL-C水平和改善HDL功能而延缓动脉粥样硬化进展的依据,以期为临床上治疗动脉粥样硬化和冠心病提供新的更有效的治疗策略和途径。研究方法1.动物分组及干预18只8周龄C57BL/6J小鼠给予普通饲料喂养作为对照组,54只8周龄apoE-/-小鼠给予高脂饲料喂养,喂养4周后随机乙醚麻醉处死两种小鼠各6只,检测相应指标作为研究基线(第4周)。其余48只apoE-/-小鼠随机分为动脉粥样硬化组(AS组)、辛伐他汀组、L-4F组和辛伐他汀+L-4F组(每组12只),剩下的12只C57BL/6J小鼠仍作为对照组。对照组和AS组小鼠继续原饲料喂养,辛伐他汀组在高脂饲料喂养基础上给予灌服辛伐他汀5mg/(kg-d),L-4F组在高脂饲料喂养基础上腹腔注射L-4F1mg/(kg-d),辛伐他汀+L-4F组予灌服辛伐他汀5mg/(kg-d)和腹腔注射L-4F lmg/(kg-d),对照组、AS组、辛伐他汀组和L-4F组小鼠给予灌服和(或)腹腔注射等体积生理盐水,第8、16周后处死5组小鼠(每组每个时间点6只)。2.血脂检测实验的第4、8和16周末在空腹12h状态下乙醚麻醉后心脏采血,3000r/min离心10min取血清。采用酶法在日本AU-5421型生化自动分析仪上测定血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、甘油三酯(triglyceride,TG)含量。3.HDL抗炎抗氧化功能检测收集实验第4、8和16周的血清标本,采用乙酸苯酯法测定屏氧酶1(PON1)活性；髓过氧化物酶(MPO)活性采用MPO试剂盒在分光光度计上测定；采用非细胞学法测定高密度脂蛋白炎症指数(HII)。4.血清高敏C反应蛋白(hs-CRP)含量测定收集实验第4、8和16周的血清标本,小鼠血清hs-CRP含量根据武汉华美生物工程有限公司提供的小鼠试剂盒说明书采用酶联免疫分析法(ELISA)检测。5.肝脏PON1mRNA和蛋白表达水平检测收集实验第4、8和16周的肝脏组织标本,肝脏PON1mRNA的表达量采用实时荧光定量(RT-PCR)进行相对定量检测(以2-△△CT表示)。免疫组化法检测肝脏PON1蛋白表达情况,应用Image-pro plus6.0专业图像分析软件半定量分析阳性细胞百分比。6.病理组织学和油红O染色观察主动脉斑块形成情况实验第4、8和16周心脏采血后,分离小鼠整条主动脉,苏木素-伊红(HE)染色观察主动脉内中膜厚度；采用油红O染色主动脉内膜斑块,拍照后应用Image-pro plus6.0专业图像分析软件分析主动脉斑块/血管内膜表面积比例。7.统计学处理所有计量资料均以均数±标准差(x±s)表示,并采用SPSS13.0统计软件进行两样本均数比较的独立样本t检验；多组间总体均数比较,采用单因素方差分析(one way ANOVA);多个样本均数间的多重比较方差齐时采用LSD-t检验,方差不齐时采用Dunnett’s T3检验；相关性分析采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.实验各组小鼠不同时间点血脂水平的变化不同时间点组内比较：对照组第4、8和16周TC、TG、LDL-C、HDL-C无明显变化(P>0.05)。AS组小鼠给予高脂饲料8周和16周与4周比较,其TC、TG、LDL-C均明显升高(P<0.05或P<0.01),16周TC、TG、LDL-C较8周升高(P<0.01)；8周HDL-C与4周比较无明显差异(P>0.05),但16周HDL-C较8周明显降低(P<0.01)。辛伐他汀组16周TC、TG较8周明显增加(P<0.05和P<0.01),HDL-C较8周明显下降(P<0.01),LDL-C无明显变化(P>0.05)。L-4F组16周TC、TG、LDL-C较8周升高(P<0.01),HDL-C明显下降(P<0.01)。辛伐他汀+L-4F组16周与其8周比较,差异无统计学意义(P>0.05)。同时间点组间相比：AS组与同时间对照组相比,其第4、8和16周TC、TG、LDL-C均明显升高(P<0.05或P<0.01),HDL-C则无明显差异(P>0.05)。辛伐他汀组与同时间AS组相比,其8周TC、TG明显下降(P<0.05或P<0.01),而LDL-C和HDL-C无明显变化(P>0.05)；其16周TC、TG和LDL-C均明显降低(P<0.05或P<0.01),但仍高于同时间对照组(P<0.01), HDL-C较AS组明显升高(P<0.05)而与同时间对照组无明显差异(P>0.05)。L-4F组与同时间AS组相比,第8和16周TC、TG、LDL-C、HDL-C均无明显变化(P>0.05)。辛伐他汀+L-4F组与同时间点(8周)对照组相比,其TC、TG、LDL-C、HDL-C均明显升高(P<0.01)；与8周AS组相比,其TC、LDL-C明显降低(P<0.01或P<0.05)；与8周辛伐他汀组比较,TC、TG、LDL-C、HDL-C均无明显差异(P>0.05)；与8周L-4F组比较,其TC、LDL-C明显降低(P<0.01,P<0.05)。辛伐他汀+L-4F组与同时间点(16周)对照组相比,其TC、TG、LDL-C均明显升高(P<0.01),HDL-C无明显差异(P>0.05)；与16周AS组相比,其TC、TG、 LDL-C明显降低(P<0.01或P<0.05)；与16周辛伐他汀组比较,TC、TG、LDL-C、 HDL-C均无明显差异(P>0.05)；与16周L-4F组比较,其TG、LDL-C明显降低(P<0.05,P<0.01)。2.辛伐他汀、L-4F以及两药联用对小鼠HDL抗炎抗氧化功能的影响2.1各组小鼠不同时间点血清PON1活性的比较不同时间点组内比较：对照组小鼠8周血清PON1活性与4周无明显差异(P>0.05),其16周血清PON1活性较4和8周明显降低(P<0.01)。AS组小鼠8周血清PON1活性较4周明显降低(P<0.01),其16周血清PON1活性较4和8周也均明显降低(P<0.01)。辛伐他汀组、L-4F组和辛伐他汀+L-4F组16周血清PON1活性与其各自8周比较均明显降低(P均<0.01)。同时间点组间相比：AS组与同期对照组相比,小鼠血清PON1活性在4周时无明显差异(P>0.05),8、16周时则明显低于对照组(P<0.01)。辛伐他汀组小鼠8周和16周血清PON1活性较同时间AS组增加(P<0.01),但仍低于同时间对照组(P<0.01)。L-4F组小鼠8周和16周血清PON1活性较同时间AS组增加(P<0.05),但仍低于同时间对照组(P<0.05),与同时间辛伐他汀组无明显差异(P>0.05)。辛伐他汀+L-4F组8周PON1活性较AS组明显升高(P<0.01),与同时间对照组、辛伐他汀组和L-4F组无明显差别(P均>0.05)；辛伐他汀+L-4F组16周PON1活性较同时间对照组明显降低(P<0.01),但明显高于同时间AS组、辛伐他汀组和L-4F组(P<0.01,P<0.05和P<0.05)。2.2各组小鼠不同时间点血清MPO活性的比较不同时间点组内比较：对照组小鼠血清MPO活性在三个时间点无明显变化(P均>0.05)。AS组小鼠8周血清MPO活性较4周明显升高(P<0.01),其16周血清MPO活性较4和8周均明显升高(P<0.01)。辛伐他汀组、L-4F组和辛伐他汀+L-4F组16周血清MPO活性与其各自8周比较均无明显差异(P均>0.05)。同时间点组间相比：AS组小鼠血清MPO活性与同时间对照组相比,在4周时差异无统计学意义(P>0.05),8周和16周时较对照组均明显升高(P<0.01)。辛伐他汀组8周和16周小鼠血清MPO活性较同时间AS组降低(P<0.01),但仍高于同时间对照组,差异均具有统计学意义(P<0.01)。L-4F组8周和16周小鼠血清MPO活性较同时间AS组降低(P<0.01),但仍高于同时间对照组(P均<0.05),而与同时间辛伐他汀组比较差异无统计学意义(P>0.05)。辛伐他汀+L-4F组8周血清MPO活性明显低于同时间AS组和L-4F组(P<0.01和P<0.05),而与同时间辛伐他汀组无明显差异(P>0.05),但仍较同时间对照组明显升高(P<0.01)；辛伐他汀+L-4F组16周MPO活性明显低于同时间AS组、辛伐他汀组和L-4F组(P<0.01,P<0.05和P<0.01),但仍较同时间对照组明显升高(P<0.05)。2.3各组小鼠不同时间点血清HII的比较不同时间点组内比较：对照组小鼠8周血清HⅡ与4周无明显差异(P>0.05),其16周血清HⅡ水平较4周和8周明显升高(P<0.01)。AS组小鼠8周血清HⅡ较4周明显升高(P<0.01),其16周血清HⅡ水平较4和8周均明显升高(P<0.01)。辛伐他汀组和L-4F组16周血清HⅡ较其8周均明显升高(P<0.05和P<0.01)。辛伐他汀+L-4F组16周HⅡ与8周比较无明显差异(P>0.05)。同时间点组间相比：AS组小鼠血清HⅡ水平与同期对照组相比,在4周时差异无统计学意义(P>0.05),8周和16周时均明显升高(P<0.01)。辛伐他汀组8周和16周小鼠血清HⅡ较同时间AS组降低(P<0.01),但仍高于同时间对照组,差异均具有统计学意义(P<0.01)。L-4F组8周和16周小鼠血清HⅡ较同时间AS组降低(P<0.05和P<0.01),但仍高于同时间对照组(P均<0.05),而与同时间辛伐他汀组比较差异无统计学意义(P>0.05)。辛伐他汀+L-4F组8周血清HⅡ明显低于AS组(P<0.01),而与同时间辛伐他汀组和L-4F组无明显差异(P>0.05),但仍较同时间对照组明显升高(P<0.05)。16周时,辛伐他汀+L-4F组HⅡ明显低于同时间AS组、辛伐他汀组和L-4F组(P<0.01,P<0.05和P<0.01),而与同时间对照组无明显差异(P>0.05)。3.辛伐他汀、L-4F以及两药联用对小鼠血清hs-CRP含量的影响不同时间点组内比较：对照组小鼠8周血清hs-CRP含量与4周无明显差异(P>0.05),其16周血清hs-CRP含量较4周和8周明显升高(P<0.01和P<0.05)。AS组小鼠8周血清hs-CRP含量较4周明显升高(P<0.01),16周hs-CRP水平较4周和8周也均明显升高(P均<0.01)。辛伐他汀组、L-4F组和辛伐他汀+L-4F组16周血清hs-CRP含量与其各自8周比较均明显升高(P均<0.01)。同时间点组间相比：AS组小鼠血清hs-CRP含量与同时间对照组相比,在4周时无明显差异(P>0.05),8周和16周时则明显升高(P<0.01)。辛伐他汀组8周和16周小鼠血清hs-CRP水平较同时间AS组降低(P<0.01),8周时与同时间对照组无明显差异(P>0.05)，16周时则明显高于同时间对照组(P<0.01)。L-4F组8周和16周小鼠血清hs-CRP水平较同时间AS组降低(P<0.05),8周时与同时间对照组、辛伐他汀组无明显差异(P>0.05),16周时则明显高于同时间对照组,而与同时间辛伐他汀组比较差异无统计学意义(P>0.05)。辛伐他汀+L-4F组8周hs-CRP含量较AS组明显降低(P<0.01),与同时间对照组、辛伐他汀组和L-4F组无明显差别(P>0.05)。辛伐他汀+L-4F组16周血清hs-CRP含量明显低于同时间AS组、辛伐他汀组和L-4F组(P<0.01,P<0.05和P<0.05),但仍较同时间对照组明显升高(P<0.01)。4.实验5组小鼠不同时间点其肝脏PON1mRNA相对表达量不同时间点组内比较：对照组小鼠肝脏PON1mRNA表达量在3个时间点无明显差异(P均>0.05)。AS组小鼠8周和16周肝脏PON1mRNA表达量均较4周明显增加(P均<0.01),而其8周与16周比较无明显差异(P>0.05)。辛伐他汀组16周肝脏PON1mRNA表达量较其8周明显升高(P<0.05)。L-4F组和辛伐他汀+L-4F组16周肝脏PON1mRNA表达量与其各自8周比较无明显差异(P>0.05)。同时间点组间相比：AS组4周肝脏PON1mRNA表达量与对照组4周比较差异无统计学意义(P>0.05),其8周和16周肝脏PON1mRNA表达较同时间对照组均明显减少(P均<0.01)。辛伐他汀组8周和16周肝脏PON1mRNA表达较同时间AS组明显增加(P均<0.01),而较同时间对照组仍减少(P<0.01和P<0.05)。L-4F组8周和16周肝脏PON1mRNA表达较同时间AS组明显增加(P均<0.01),与同时间辛伐他汀组比较差异无统计学意义(P>0.05),但较同时间对照组仍减少(P均<0.05)。辛伐他汀+L-4F组8周时肝脏PON1mRNA表达较同时间AS组明显增加(P<0.01),与同时间辛伐他汀组和L-4F组比较均无明显差异(P>0.05),但仍低于对照组8周(P<0.05)；16周时其表达较同时间AS组、辛伐他汀组和L-4F组均明显增加(P<0.01,P<0.05和P<0.01),与同时间对照组比较仍明显减低(P<0.01)。5.实验5组小鼠不同时间点其肝脏PONl蛋白的表达情况不同时间点组内比较：对照组小鼠肝脏PON1蛋白表达量在3个时间点无明显差异(P均>0.05)。AS组4周肝脏PON1蛋白表达量和8周比较差异无统计学意义(P>0.05),其16周肝脏PON1蛋白表达较4周和8周均明显减少(P均<0.01)。辛伐他汀组、L-4F组和辛伐他汀+L-4F组16周肝脏PON1蛋白表达量较其各自8周均明显减少(P均<0.01)。同时间点组间相比：AS组4周肝脏PON1蛋白表达量与对照组4周比较差异无统计学意义(P>0.05),其8周和16周肝脏PON1蛋白表达较同时间对照组均明显减少(P均<0.01)。辛伐他汀组8周和16周时肝脏PON1蛋白表达较同时间AS组明显增加(P<0.05和P<0.01),但仍低于同时间对照组(P均<0.01)。L-4F组8周肝脏PON1蛋白表达与同时间AS组和辛伐他汀组比较无明显差异(P>0.05),但较同时间对照组仍明显减低(P<0.01)；其16周肝脏PON1蛋白表达较同时间AS组明显增加(P<0.01),但仍低于同时间对照组(P<0.01),与同时间辛伐他汀组比较无明显差异(P>0.05)。辛伐他汀+L-4F组8周肝脏PON1蛋白表达较AS组8周明显增加(P<0.01),与同时间辛伐他汀组、L-4F组比较无统计学差异(P>0.05),但较对照组8周仍明显减少(P<0.01)；16周肝脏PON1蛋白表达较同时间AS组、辛伐他汀组和L-4F组明显增加(P<0.01,P<0.05和P<0.01),但仍低于同时间对照组(P<0.01)。6.实验各组小鼠主动脉内中膜厚度(IMT)的变化不同时间点组内比较：对照组4周、8周和16周小鼠主动脉内中膜厚度比较无明显差异(P>0.05)。AS组8周和16周小鼠主动脉内中膜厚度较4周明显增加(P<0.01),8周和16周比较差异无统计学意义(P>0.05)。辛伐他汀组、L-4F组和辛伐他汀+L-4F组16周主动脉内中膜厚度与其各自8周比较均无明显差异(P>0.05)。同时间点组间相比：AS组4周、8周和16周小鼠主动脉内中膜厚度较同时间对照组明显增加(P均<0.01)。辛伐他汀组主动脉内中膜厚度较同时间AS组明显减少(P<0.01),但仍较同时间对照组增厚(P<0.01)。L-4F组8周和16周主动脉内中膜厚度较同时间AS组明显减少(P<0.05和P<0.01),但仍较同时间对照组增厚(P<0.01),与同时间辛伐他汀组比较无明显差异(P>0.05)。辛伐他汀+L-4F组8周主动脉内中膜厚度较同时间AS组、L-4F组明显减少(P<0.01和P<0.05),与同时间辛伐他汀组比较无明显差异(P>0.05),但仍较同时间对照组增厚(P<0.01)；16周主动脉内中膜厚度较同时间AS组明显减少(P<0.01),但仍较同时间对照组增厚(P<0.01),与同时间辛伐他汀组和L-4F组比较无明显差异(P>0.05)。7.实验各组小鼠主动脉内膜斑块面积的比较不同时间点组内比较：对照组主动脉斑块／血管内膜表面积比值在4、8和16周无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。AS组8、16周主动脉斑块／血管内膜表面积比值均较4周增加(P<0.01),AS组8周主动脉斑块/血管内膜表面积比值和16周差异无统计学意义(P>0.05)。辛伐他汀组和L-4F组16周小鼠主动脉斑块/血管内膜表面积比值较其8周均明显升高(P均<0.01)。辛伐他汀+L-4F组16周小鼠主动脉斑块/血管内膜表面积比值与8周比较无明显差异(P>0.05)。同时间点组间相比：AS组4周、8周和16周主动脉斑块/血管内膜表面积比值且明显高于同时间对照组(P均<0.01)。辛伐他汀组小鼠8周和16周主动脉斑块/血管内膜表面积比值较同时间AS组明显减小(P<0.01和P<0.05),但仍明显高于同时间对照组(P<0.01)。L-4F组小鼠8周和16周斑块/血管腔表面积较同时间AS组减小(8周：P<0.01,16周：P<0.05),与同时间辛伐他汀组比较差异无统计学意义(P>0.05),但仍明显高于同时间对照组((P均<0.01)。辛伐他汀+L-4F组小鼠8周主动脉斑块/血管内膜表而积比值较同时间AS组明显减小(P<0.01),与辛伐他汀组和L-4F组无明显差异,但仍明显高于同时间对照组(P均<0.01)。辛伐他汀+L-4F组16周主动脉斑块/血管内膜表面积比值,较同时间AS组、辛伐他汀组和L-4F组均明显减小(P<0.01,P<0.01和P<0.05),但仍明显高于同时时间对照组组(P均<0.01)。8.相关性分析小鼠血清PON1活性与hs-CRP.IMT和主动脉斑块/血管内膜表面积比值呈显著负相关关系(r=-0.803,P=0.000；r=-0.615,P=0.000；r=-0.669,P=0.000),MPO活性和HⅡ与hs-CRP、主动脉IMT和主动脉斑块/血管内膜表面积比值均呈正相关关系(MPO:r分别为0.657、0.838和0.882,P均=0.000；HⅡ：r分别为0.730、0.746和0.798,P均=0.000)。结论1.辛伐他汀可降低高脂饮食apoE-/-小鼠血清LDL-C,升高血清HDL-C水平；apoA-I模拟肽L-4F对高脂饮食apoE-/-小鼠血脂水平无明显影响。2.辛伐他汀和L-4F均可通过上调肝脏PON1表达而升高PON1活性,同时降低MPO活性,减低HⅡ,从而改善HDL抗炎、抗氧化功能,这可能是两药延缓动脉粥样硬化进展的重要机制之一。3.以辛伐他汀为基础联用L-4F的联合调脂方案,不仅降低胆固醇水平,而且更有效改善HDL抗炎抗氧化功能,从而增加HDL的抗动脉粥样硬化功能,以延缓动脉粥样硬化进展,更优于单药应用。