分化抑制因子,又称DNA结合抑制因子(Inhibitors of differentiation/DNA binding,Id)属于螺旋-环-螺旋(HLH)转录因子家族成员之一,对碱性HLH(bHLH)转录因子活性起负调节作用。哺乳动物细胞含四种Id分子(Id1～Id4)。Id3,作为血清诱导的立即早期基因第一次在小鼠成纤维细胞系中被发现,该分子参与多种细胞生物学过程,包括淋巴细胞发育、骨骼肌分化、血管平滑肌增殖、肿瘤诱导的血管生成等。人Id3基因cDNA编码区基因全长360 bp,编码产物含有119个氨基酸残基,分子量(Mr)约13 000。本课题参照Genebank中人Id3 cDNA序列设计了一对特异引物,以前期实验中从人前列腺癌细胞株PC-3M中克隆得到的Id3/pGEM-T为模板,用PCR方法扩增Id3 cDNA,将其重新克隆到pGEM-T载体中,得到的重组质粒Id3/pGEM-T以EcoR I酶切、PCR扩增及DNA测序进行鉴定。测序结果与Genebank报道的人Id3 cDNA序列完全相同。重组克隆载体Id3/pGEM-T用EcoR I和Sal I双酶切,将纯化回收的Id3酶切片段插入到原核表达载体pET-32a(+)的EcoR I和Sal I位点之间,构建了原核表达载体Id3/pET32a,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导目的基因的表达。rhId3在大肠杆菌中的表达量可占菌体总蛋白的20%左右。先后采用不同浓度的IPTG、不同的诱导时间、不同的诱导温度来进行诱导,发现在低温25℃、0.2 mmol/L IPTG诱导8 h后,可溶性融合蛋白的表达量较略多。本实验分别在非变性和变性条件下纯化了可溶性融合蛋白和包涵体内融合蛋白,经过Ni-NTA亲和层析柱纯化,获得纯度大于90%的纯品。经SDS-PAGE电泳和Western blot验证,证实人Id3蛋白在大肠杆菌BL21中得到表达。近年来研究表明,Id3在人类细胞中的表达水平随细胞生长周期和生理状态的变化而变化,并对细胞外的不同刺激做出不同的应答反应。有关Id3在细胞周期调控和细胞凋亡中的作用目前还缺乏深入研究,某些研究尚未取得一致的结论。本课题试图通过研究化疗药物顺铂对人Burkitt’s B淋巴瘤(Daudi)细胞生长周期的影响以及Id3在此过程中的作用来探讨Id3在顺铂诱导人Burkitt’s B淋巴瘤(Daudi)细胞增殖抑制和凋亡中的作用。将Daudi细胞分成对照组和药物处理组(顺铂浓度为2μg/ml),流式细胞术(FCM)分析两组细胞的周期进程和凋亡率;用RT-PCR法检测顺铂处理前后Id3 mRNA的变化,同时与Id2、钙调素mRNA的变化进行对比;用Western blot观察Id3蛋白水平的变化。结果发现,Daudi细胞增殖抑制率随顺铂浓度的增加而增加;与空白组相比,2μg/ml浓度的顺铂作用24 h后,Daudi细胞表现出G1期阻滞,S期和G2/M期细胞比例下降;Annexin V/PI staining和FCM结果表明,实验组细胞凋亡率(7.04±0.41)%较对照组(4.54±0.67)%显著增加(P<0.05);RT-PCR结果显示,顺铂诱导Daudi细胞增殖抑制的同时可引起Id3 mRNA的明显上调表达。上述结果表明,顺铂诱导Daudi细胞后,引起Id3 mRNA的上调表达,Id3的上调表达可能参与了顺铂诱导的Daudi细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡,达到抑制肿瘤细胞生长的目的。