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流感病毒作为一种重要的人兽共患病病原,能够感染野生动物与家禽家畜,同时也威胁着人类的健康。流感病毒属于正黏病毒科,分为传统的甲（A）、乙（B）、丙（C）型流感病毒与新发现的以牛为主要宿主的丁（D）型流感病毒四型。流感病毒能够通过不断的变异,频繁地从动物跨物种传播感染人类,引发季节性流感疫情,甚至全球范围内流感大流行。流感病毒基因组的转录与复制功能都由流感病毒聚合酶蛋白执行,聚合酶蛋白复合体是决定病毒能否跨种传播以及传播效率高低的关键蛋白之一。流感病毒聚合酶活性降低,抑制流感病毒RNA转录,降低流感病毒复制效率。流感病毒聚合酶蛋白复合体上如果出现氨基酸位点的突变,可能造成病毒聚合酶活性的改变,其中如果突变对病毒聚合酶活性有增强作用,则可能提高流感病毒复制效率,从而影响病毒对哺乳动物的致病性。在本研究中选择在野鸟和家禽中广泛流行的H3N2亚型流感病毒,经典的H1N1亚型流感病毒,新发现的D型流感病毒进行深入分析。针对H3N2亚型流感病毒,我们选择在野鸟中广泛发现的H3N2亚型流感病毒A/Baikal teal/Shanghai/SH-89/2013株作为研究目标,通过构建H3N2流感病毒聚合酶PB2随机突变文库,筛选测试哪些氨基酸位点发生突变可能增强病毒聚合酶活性,进而导致病毒复制效率增强。通过筛选实验,我们发现在H3N2流感病毒PB2蛋白上存在多个影响病毒聚合酶活性的氨基酸位点。其中H3N2-PB2-D455L突变会导致病毒聚合酶活性提高9.42倍。随后通过流感病毒反向遗传操作技术,在体外成功拯救SH89株与SH89-PB2-D455L突变株。将两株病毒通过滴鼻的方式接种小鼠,记录小鼠体重变化,计算小鼠体内各器官病毒滴度,绘制体外复制动力学曲线,分析H3N2-SH89流感病毒PB2氨基酸位点突变对其复制效率产生的影响。通过研究发现SH89-PB2-D455L突变株在MDCK细胞中滴度高于SH89株,尤其在感染初期差异显著,并且该突变能够提高病毒在小鼠体内的复制能力。我们的研究提供了针对H3N2亚型流感病毒新的分子标记,提高了对H3N2流感病毒突变的监测水平,为流感流行监测工作提供参考。针对H1N1亚型流感病毒,我们选择了HIN1亚型经典株A/Puerto Rico/8/1934（PR8株）。构建PR8疫苗骨架株聚合酶PB2随机突变文库,筛选能够提高PR8疫苗株病毒在Vero细胞和MDCK细胞中增殖能力的关键氨基酸位点。通过筛选实验,我们发现在PR8疫苗骨架株PB2蛋白中,PB2-V344S突变能够使病毒聚合酶活性提高6.9倍,PB2-S582P突变能够使病毒聚合酶活性提高9.3倍,PB2-G590D突变能够使病毒聚合酶活性提高4.5倍,PB2-Q350L突变能够使病毒聚合酶活性提高4.7倍,PB2-T530A突变能够使病毒聚合酶活性提高4.7倍。通过病毒反向遗传操作技术,在体外成功拯救AK-PR8病毒株以及AK-PR8-PB2-V344S、AK-PR8-PB2-S582P、AK-PR8-PB2-G590D、AK-PR8-PB2-Q350L、AK-PR8-PB2-T530A五株突变株。测试五株突变病毒和AK-PR8株在Vero细胞与MDCK细胞上的复制动力学,评价这些突变是否能够影响病毒的复制能力。经研究发现AK-PR8-PB2-V344S、AK-PR8-PB2-S582P、AK-PR8-PB2-T530A三株拯救的突变病毒在MDCK细胞上和Vero细胞上的滴度均高于AK-PR8株,其中PB2-T530A突变对病毒复制能力的影响最大。而AK-PR8-PB2-G590D株与AK-PR8株在细胞中滴度相同,说明该突变对病毒复制能力没有造成影响。AK-PR8-PB2-Q350L株与AK-PR8株相比滴度降低明显,说明病毒聚合酶活性提高导致病毒复制能力增强的现象不是绝对的。我们同时测试了这些突变是否能够提高病毒在鸡胚中的复制能力。实验中我们发现其中三个氨基酸位点发生突变,PB2-V344S、PB2-S582P和PB2-T530A,能够提高流感病毒聚合酶活性,这三个位点可以作为改造PR8疫苗骨架株的氨基酸位点,提高PR8疫苗株病毒复制效率及其在鸡胚和细胞中的病毒滴度。PR8疫苗骨架株常作为疫苗研发中内部基因的供体株,通过突变提高病毒在细胞系培养中的滴度,可提高流感疫苗的产量并降低疫苗生产的成本。因此,我们筛选的PB2-T530A突变有望引入到PR8疫苗骨架株中,为研发新的以细胞系为生产基质的流感疫苗提供更理想的供体选择。针对新发现的D型流感病毒,我们将A型流感病毒对哺乳动物致病性增强的两个关键位点PB2-627和PB2-701的突变引入到D型流感病毒中,并测试这两个位点的突变是否能同样对D型流感病毒复制效率产生影响。通过双荧光素酶报告基因检测系统实验,表明PB2-627K突变不能增强D型流感病毒聚合酶活性;PB2-701D突变可使D型流感病毒聚合酶活性增强1.47倍,PB2-701N突变可以使聚合酶活性提高1.20倍。我们在实验中建立D型流感病毒聚合酶PB2随机突变文库,通过筛选实验,发现在D型流感病毒中存在多个对病毒聚合酶活性产生影响的位点。其中影响较大的两个位点突变为PB2-D533S和PB2-G603Y,分别可提高病毒聚合酶活性9.92倍和8.22倍。而将PB2-D533S和G603Y双点同时突变也能提高病毒聚合酶活性1.46倍,但远低于两个独立突变使病毒聚合酶活性增强的效果,这可能因为两点同时突变对病毒聚合酶结构的未知改变,导致增强病毒聚合酶活性效率的下降。我们同时还通过大量实验,利用分子克隆等手段构建D型流感病毒的十一质粒与七质粒反向遗传操作系统尝试对病毒进行拯救工作。研究表明,D型流感病毒拯救工作存在一定困难,将其感染细胞系发现,除在ST细胞中能够复制一代外,后续均不能在MDCK、ST细胞中进行复制。高通量测序分析结果表明,D型流感病毒PB1-Y320C突变,P3-T452A突变可能是影响病毒在细胞内复制能力的关键性氨基酸位点,在后续工作中会加强实验进行分析,并持续推进D型流感病毒的拯救工作。本研究中发现的关键氨基酸位点,为及时发现新出现的高致病性流感病毒提供分子标记,同时可以增强对流感病毒的监测能力,提升对流感病毒分子基础的认知。通过我们建立的方法,筛选能够提高疫苗病毒株复制效率的关键性位点,为应对潜在的流感大流行以及流感灭活疫苗的生产提供重要的指导意义。