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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,在全球范围内其发病率和死亡率都位居前列。早期HCC患者通过手术切除、肝移植以及动脉栓塞等方法可取得不错的治疗效果,但是也只有很少部分患者能够治愈(<10%),大部分患者会进入进展期。目前,进展期HCC尚缺乏有效的治疗手段,导致患者预后极差。开发新的针对进展期HCC的治疗方法用于提高患者预后生存时间是迫切的医学需求,继续深入探索并揭示HCC发生发展的分子机制是实现该需求的重要基础。泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific proteases,USPs)是去泛素化酶(deubiquitylating enzyme,DUBs)家族最大的亚族,该族成员通过催化移除靶蛋白的泛素修饰,从而抑制靶蛋白的泛素-蛋白酶体途径降解或者影响靶蛋白的内吞、转运以及活性。新近研究揭示USPs表达异常导致多种关键蛋白稳定性或者活性改变,广泛参与肿瘤细胞DNA损伤修复、增殖、凋亡以及侵袭转移。然而,USPs在HCC中的重要作用和分子机制很少被揭示。在本次研究中,我们希望通过三个研究部分阐明USPs家族成员USP2在HCC中发挥的重要作用和分子机制,包括:(1)USP2在HCC临床组织样本中的表达及其与患者临床病理特征的相关性研究;(2)USP2对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响研究;(3)USP2通过Rab1A影响HCC细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制研究。以此,为以USP2为HCC治疗靶点提供理论依据和实验基础。一、USP2在HCC临床组织样本中的表达及其与患者临床病理特征的相关性研究目的:通过检测USP2在HCC临床组织样本中的表达水平以及分析其表达与患者临床病理特征的相关性,初步探讨USP2是否参与HCC进程。方法:在我院收集20例新鲜HCC及其配对癌旁组织,利用western blotting实验检测USP2在这20对HCC组织中的表达水平;制作包含100例HCC及其配对癌旁组织的组织芯片,通过免疫组化染色检测USP2在该组织芯片中的表达,并采用卡方检验和Kaplan-Meier生存法分析USP2表达与患者临床病理特征和生存预后的相关性。结果:在20例新鲜HCC及其配对癌旁组织中检测发现,USP2在其中12例(60%)HCC组织中表达显著高于配对癌旁组织;组织芯片免疫组化染色结果同样显示USP2在HCC组织中表达显著高于癌旁组织;统计分析结果显示USP2表达与HCC患者病理分级以及肝门淋巴结转移显著正相关,而与患者的性别、年龄、肿瘤大小、HBV感染以及AFP值无明显相关性。同时,Kaplan-Meier生存分析表明USP2高表达的患者预后更差。结论:USP2在HCC组织中表达显著增高,并且与患者的病理分级、肝门淋巴结转移以及不良预后显著正相关,提示USP2可能参与HCC的恶性进展。二、USP2对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响研究目的:探讨USP2对HCC细胞增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为的影响。方法:Western blotting实验检测USP2在HCC细胞系中的表达水平;利用携带USP2干扰序列的慢病毒感染HCC细胞,获取USP2表达沉默的稳定细胞模型,通过CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验、划痕实验、Transwell小室迁移实验以及Matrigel侵袭实验检测USP2表达沉默对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响;利用携带USP2过表达的慢病毒感染HCC细胞,获取USP2过表达的稳定细胞模型,通过上述细胞生物功能学实验检测USP2过表达对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响;利用裸鼠荷瘤模型检测USP2表达沉默或者过表达在体内对HCC细胞生长和转移的影响。结果:与人正常肝细胞系L02相比较,USP2在HCC细胞系HepG2、SK-Hep1和SMMC-7721中呈现显著高表达,在Huh7与MHCC97-H中表达未见显著差异;在HepG2和SK-Hep1细胞中沉默USP2表达后,肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭受到显著抑制;在Huh7细胞中过表达USP2后,肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭得到明显促进;裸鼠荷瘤实验检测发现SK-Hep1细胞沉默USP2表达后,皮下瘤生长能力显著减弱;Huh7细胞过表达USP2后,皮下瘤生长能力显著增强;此外,SK-Hep1细胞沉默USP2表达后,皮下瘤转移能力受到明显抑制。结论:USP2可显著促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭。三、USP2通过Rab1A影响HCC细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制研究目的:揭示USP2促进HCC增殖、迁移和侵袭可能的分子机制。方法:在HCC细胞HepG2和SK-Hep1中分别感染携带Flag标签的USP2过表达慢病毒;利用抗-Flag-USP2抗体在HepG2和SK-Hep1细胞中分别进行IP实验沉淀下可能与USP2直接结合的蛋白,进一步通过LC-MS/MS(液相色谱-质谱)技术对沉淀的蛋白进行鉴定,并筛选重要靶蛋白进行后续研究;在HepG2和SK-Hep1细胞中,分别共感染USP2和靶蛋白过表达慢病毒,利用免疫共沉淀(CO-IP)实验和细胞免疫荧光(ICC)实验验证USP2与靶蛋白的直接结合;利用qRT-PCR和Western blotting实验检测USP2表达沉默或者过表达对靶蛋白转录和蛋白水平表达的影响;利用CHX蛋白稳定性实验检测USP2表达沉默或者过表达对靶蛋白稳定性的影响;SK-Hep1细胞共感染靶蛋白过表达慢病毒和USP2干扰慢病毒或者Huh7细胞共感染靶蛋白过表达慢病毒和USP2过表达慢病毒,细胞经过MG132处理后,利用IP实验检测USP2表达沉默或者过表达对靶蛋白泛素链修饰的影响;SK-Hep1细胞共感染USP2干扰慢病毒和靶蛋白过表达慢病毒,利用CCK-8细胞增殖实验和Transwell小室迁移实验验证USP2通过靶蛋白促进HCC恶性进展;Western blotting实验检测靶蛋白在HCC细胞系和临床组织样本中表达水平,分析USP2与蛋白表达的相关性。结果:通过IP实验在HepG2细胞中沉淀下210个可能与USP2直接结合的蛋白,在SK-Hep1细胞中沉淀下279个可能与USP2直接结合的蛋白,其中121个蛋白在两个细胞中发生了重叠。进一步,我们选取排名前十的重叠蛋白进行深入背景分析与初步验证后,确定Rab1A(Ras-related protein Rab-1A)蛋白可能为USP2下游靶蛋白。Rab1A属于小分子GTP酶Rab家族成员,主要参与调节内质网-高尔基体间的囊泡转运,该转运系统涉及细胞生长、脂质代谢以及自噬等重要信号的传递。研究证实Rab1A表达增加促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。CO-IP实验证实在HCC细胞中USP2与Rab1A存在直接结合,ICC实验显示在HCC细胞中USP2与Rab1A定位存在高度重合;qRT-PCR实验结果显示,在HepG2和SK-Hep1细胞中沉默USP2表达后Rab1A的mRNA表达无显著差异,在Huh7细胞中过表达USP2后Rab1A的mRNA表达同样无显著差异;Western blotting实验结果显示,在HepG2和SK-Hep1细胞中沉默USP2表达后Rab1A蛋白表达显著降低,在Huh7细胞中过表达USP2后Rab1A蛋白表达显著增加;CHX蛋白稳定性实验显示,SK-Hep1细胞中沉默USP2表达后Rab1A蛋白稳定性明显下降,Huh7细胞中过表达USP2后Rab1A蛋白稳定性明显增加;在检测USP2对Rab1A泛素化修饰影响时发现,SK-Hep1细胞中沉默USP2表达后Rab1A蛋白K48-多聚泛素链修饰显著增加,Huh7细胞中过表达USP2后Rab1A蛋白K48多聚泛素链修饰减少;功能恢复实验显示,SK-Hep1细胞中沉默USP2表达对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用在过表达Rab1A后出现了明显恢复;最后,western blotting实验结果显示USP2与Rab1A在HCC细胞系和临床组织样本中的表达显著正相关。结论:(1)在HCC细胞中USP2与Rab1A蛋白存在直接结合;(2)USP2影响Rab1A表达是通过蛋白水平而非转录水平;(3)USP2增加Rab1A蛋白稳定性;(4)USP2去泛素化修饰Rab1A蛋白,移除Rab1A蛋白K48-多聚泛素链修饰;(5)USP2通过Rab1A促进HCC恶性进程;(6)USP2与Rab1A在HCC细胞系和临床组织样本中表达显著正相关。总之,USP2通过去泛素化修饰Rab1A蛋白,增加其稳定性,促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭。通过上述三部分研究,我们认为:USP2在HCC中是一个明确的促癌蛋白,高表达的USP2通过去泛素化修饰并稳定Rab1A蛋白,促进HCC增殖、迁移和侵袭,导致患者预后生存时间减少。