论文部分内容阅读
第一部分脑苷肌肽对APPswe/PS1dE双转基因小鼠大脑皮层和海马p.淀粉样蛋白42和胶质纤维酸性蛋白表达的影响目的及意义：阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)是老年期痴呆中最常见的类型,发病率高,主要临床表现为进行性认知功能障碍,而后发展为痴呆,最终导致生活自理能力完全丧失。AD的主要病理性改变表现在脑内出现老年斑(senile plaque, SP)和神经纤维缠结(Neurofibrillary Tangles, NFTs)二个方面并伴有突触和神经元缺失。目前在AD的众多发病机制中β-淀粉样蛋白(amyloid protein, Aβ)级联假说最受关注。星形胶质细胞是脑内分布最广泛,体积最大的一种神经胶质细胞,对神经元具有支持、保护与修复、营养和递质调控及免疫等多种作用,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞特有的标志物,其含量或结构的改变不仅能反映星形胶质细胞的形态变化,更能反映神经元受损的程度与范围。脑苷肌肤(Cattle Encephalon Glycoside and Ignotin Injection,CEGI)为小分子多肽氨基酸和多种神经节苷脂成分,对促进神经再生和恢复神经功能有重要作用。本研究旨在利用APPswe/PS1dEc叉转基因模型小鼠.通过Morris水迷宫行为学测定、观察p-淀粉样蛋白(Aβ42)和GFAP的变化,探讨CEGI对AD的治疗作用,为CEGI在临床上应用于AD的治疗提供理论基础和实验依据。方法：选取5月龄APPswe/PS1dE9双转基因AD模型小鼠共90只,随机分组：模型组(Tg),脑苷肌肤低剂量组(Tg+CEGI-L),脑苷肌肽中剂量组(Tg+CEGI-M),脑苷肌肽高剂量组(Tg+CEGI-H),安利申组(Tg+Doneplize)和脑苷肌肤中剂量+安理申联合用药组(Tg+CEGI+Doneplize),每组各1 5只,共6组。同月龄同背景非转基因野生型C57BL/6J小鼠10只作为正常对照组(nTg组)。7组动物分别给予生理盐水、不同剂量的CEGI、安理申30 d后,进行6天的Morris水迷宫行为学评定。通过应用苏木素-伊红(HE)、硫磺素-S荧光染色(Thioflavin-S)、免疫组织化学(IHC)、免疫印迹法(Western Blot)检测小鼠海马及皮层Aβ42、GFAP表达的变化。结果：(1)小鼠体重结果显示在CEGI治疗前后无明显改变,各组比较差异无统计学意义(P>0.05)；(2) Morris水迷宫行为检测结果,与Tg组比较,Tg+CEGI-M组在60 s的时间内穿台次数增加(P<0.05)；与Tg组比较,nTg组、Tg+CEGI+Donepezil组在60 s的时间内穿台次数显著增加(P<0.01); (3)海马Aβ42老年斑的数目、面积结果显示,与Tg组比较,Tg+ Donepezil组、Tg+ CEGI +Donepezil组均有所减少、减小,差异均有统计学意义(P<0.001)；(4)皮层Ap42老年斑的计数、面积结果显示,与Tg组比较,Tg+CEGI-M组、Tg+CEGI-H组、Tg+Donepezil组、Tg+CEGI+Donepezil组4组均有所减少、减小,差异均有统计学意义(P<0.005)；(5)海马CA1区、CA3区GFAP的表达,与Tg组比较,Tg+CEGI-M组、Tg+CEGI-H组、Tg+Donepezil组、Tg+CEGI+Donepezil组4组GFAP的表达的数量减少。结论：(1) CEGI治疗显著改善了APPswe/PS1dE9汉转基因小鼠的空间学习和记忆能力。(2) CEGI治疗能显著降低APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ42的产生和表达,且CEGI中剂量治疗效果更为显著。(3)CEGI治疗能降低星型胶质细胞GFAP的表达。上述研究结果表明：CEGI能通过抑制Aβ42在APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑中的产生、聚集和表达,能降低星型胶质细胞GFAP的表达,进而改善APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的学习记忆能力,对AD具有明确的治疗作用。第二部分脑苷肌肽对APPswe/PS1dE双转基因小鼠海马钙结合蛋白.D28K、维生素D受体表达的影响目的及意义：AD发病机制包括Aβ损伤学说、Tau蛋白异常修饰、钙稳态失衡、炎症、胆碱能、基因突变等,目前广泛认可的是Ap是AD发病的始动因子,而Ap的神经毒性作用会影响神经元的钙离子信号通路,导致钙超载并具有神经毒性,进而影响学习记忆的机制,同时诱导神经元细胞的死亡。钙结合蛋白-D28K(Calbindin D28K, CB)主要存在于神经元的胞浆、轴突及某些脑区神经元的树突中,具有维持神经元的钙稳态,降低神经元因钙离子浓度过高的毒性作用。维生素D受体(VDR)与维生素D结合可调节钙离子通道,影响胞内钙离子水平,维持钙稳态,减少其神经毒性作用。本研究旨在利用APPswe/PS1De9双转基因小鼠,观察神经元保护性蛋白、具有缓冲细胞内钙离子能力的CB和VDR表达的变化,探讨CEGI对AD的治疗作用,从而为CEGI在临床上应用于AD的治疗提供理论基础和实验依据。方法：选取5月龄APPswe/PS1dE9殴转基因AD模型小鼠共90只,随机分组：模型组(Tg),脑苷肌肽低剂量组(Tg+CEGI-L),脑苷肌肽中剂量组(Tg+CEGI-M),脑苷肌肽高剂量组(Tg+CEGI-H),安利申组(Tg+Doneplize)和脑苷肌肽中剂量+安理申联合用药组(Tg+CEGI+Doneplize),每组各15只,共6组。同月龄同背景非转基因野生型C57BL/6J小鼠12只作为正常对照组(nTg组)。7组动物分别给予生理盐水、不同剂量的CEGI、安理申30 d后.进行6天的Morris水迷宫行为学评定。通过免疫组织化学(IHC)、RT-PCR、免疫印迹法(Western Blot)检测小鼠海马CA1区、CA3区的CB、VDR表达的变化。结果：(1)小鼠海马CA1区、CA3区的CB表达,其他6组的蛋白表达均高于Tg组,差异均有统计学意义(P<0.05)：(2)小鼠海马CB的mRNA、Western Blot表达结果与免疫组化一致;(3)小鼠海马CA1区、CA3区的VDR表达,与nTg组、Tg+CEGI+Donepezil组比较,Tg组蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)：结论：CEGI的治疗显著上调了APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马CB、VDR的表达,从而增强与神经元内钙离子的螯合、缓冲钙离子浓度过高引起的神经毒性,具有神经保护作用