论文部分内容阅读
猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）引起的一种以肠炎、急性水样腹泻、脱水、呕吐、体重减轻和精神萎靡等典型症状为特征的急性传染性疾病,不同日龄的猪均易感染,且新生仔猪的发病率和死亡率高达80%-100%。自2010年以来,以S基因变异为主要特征的PEDV毒株在全国范围内暴发,给我国养猪业造成了严重的经济损失。根据S基因进化树分析,我国流行的PEDV强毒力变异毒株属于GII型,该类毒株主要特征是相比于经典毒株,在其S基因中存在着不同程度的插入、缺失或碱基的置换等突变,并导致基于GI型PEDV CV777毒株的传统疫苗无法提供有效的保护。因此,在体外分离GII型毒株对研究PEDV的分子生物学特征、致病机制及新型有效疫苗的研制具有重要作用。此外,为了进一步研究PEDV流行毒株的分子致病机制,以前期分离的流行毒株为亲本建立反向遗传操作平台就显得十分必要。本研究将采集自河北的PEDV阳性样品接种于Vero细胞,经过连续体外传代培养,成功的在体外分离到了GIIa基因型CH/HBXT/2018毒株。CH/HBXT/2018毒株能够在Vero细胞上稳定传代并产生典型的细胞病变（CPEs）,仔猪致病性试验结果显示该毒株在仔猪中具有很强的致病性,能够引起较高的感染率和死亡率,并伴随着呕吐、腹泻、极度消瘦和其他典型的临床症状。半数仔猪腹泻量(The median pig diarrhea dose,PDD50)在攻毒后7天可达到8.63 PDD50/3 mL。该毒株的成功分离为今后研制新型、有效的PEDV疫苗奠定了材料基础。此外,以上述分离到的GIIa型PEDV CH/HBXT/2018毒株及实验室先前保存的GIIb型PEDV CH/HNPJ/2017毒株为亲本,利用体外连接技术对两株流行毒株进行了病毒基因组全长的构建。首先将两株毒株的全长基因组分为六个相邻的DNA片段并获得相应的克隆,并在A片段5′端和F片段3′端分别引入T7启动子序列和PolyA结构。然后利用限制性内切酶及T4 DNA连接酶,并通过体外转录的方法成功获得了PEDV CH/HNPJ/2017和PEDV CH/HBXT/2018毒株基因组cDNA克隆,为进一步拯救病毒和反向遗传平台的构建及应用奠定了基础。