内镜作为一种微创性新型诊断治疗工具已广泛应用于临床,为疾病的诊治与预防起到了积极的作用。但调查显示我国的内镜应用普遍存在实际工作量超过理论工作量、医护人员缺乏内镜清洗消毒相关知识和内镜清洗消毒操作流程不规范等问题。且临床内镜使用的高周转率和内镜本身结构与材质的特殊性容易导致内镜形成生物膜(Biofilm)。生物膜对外界环境抵抗力强,常在反复使用、处理、再使用的循环过程中逐渐累积；当积累到一定厚度时,消毒及灭菌因子均难以杀灭包裹于其中的细菌,因此是造成内镜清洗消毒失败和患者潜在医院感染的重要原因之一。以上原因综合作用,使得内镜生物膜的高发生率不仅严重威胁内镜诊疗患者的安全,并且不利于内镜技术的发展。国外有调查发现内镜钳子管的生物膜发生率高达38%～42%,但我国临床内镜生物膜实际发生情况尚未经检测证实。随着医疗卫生机构对内镜清洗消毒和医院感染的重视度不断提高,各内镜专业学术机构纷纷出台与内镜清洗消毒相关的临床指南和标准,但大多未能对内镜生物膜的预防和清除予以关注。现阶段的研究主要着重于生物膜形成机制的基础研究,还尚未能为预防生物膜的形成及其清除提供依据。针对内镜生物膜可能带来的医院感染问题,曾有报道指出内镜刷洗步骤对内镜生物膜的清除效果较好,但尚缺乏有力的研究证明。调查发现美国各内镜机构的清洗方法及刷洗次数各异,由此导致内镜清洗效果较难得到保证。我国2004年颁布的《内镜清洗消毒技术规范》对内镜再处理步骤中的许多问题也缺乏明确说明,因而各临床内镜机构对污染后内镜的再处理仍未形成统一规范。我们的前期研究已经采用大肠埃希菌成功进行了内镜生物膜模型的建立、软式内镜刷洗新方法的效果研究及不同清洗剂清除内镜生物膜的实验研究等,为进一步探索内镜刷洗步骤对生物膜的清除效果提供了一定的研究基础。内镜的刷洗对生物膜的清除作用可能带来比内镜清洗剂和消毒剂更佳的效果。因此,本研究在前期研究的基础上,以收集临床使用过的内镜钳子管进行实验室检测和问卷调查,进而探讨清洗消毒情况与我国内镜钳子管生物膜的发生情况。并继续深入研究优化内镜刷洗方法对生物膜的清除作用,通过进一步制作大肠埃希菌内镜生物膜模型,对其进行内镜再处理干预的多因素、多水平研究,分析刷洗方法对内镜生物膜的清除效果,以探索有效的刷洗对内镜生物膜的清除效果。从而更好的预防和清除生物膜的发生,为通过临床内镜的再处理防止生物膜的形成提供理论依据,预防由内镜引起的医院感染,保障医疗安全。目的本研究对国内内镜生物膜发生率进行了小样本的实验室验证性检测,并结合对与之对应的临床再处理实施情况进行调查分析。为了解我国临床内镜生物膜发生情况提供初步数据,并分析其与临床实际再处理步骤之间的相关性。通过建立大肠埃希菌内镜生物膜模型,对内镜再处理过程中手工清洗步骤进行干预,研究内镜刷洗方法对内镜生物膜的清除作用,筛选出最佳的刷子结构和刷洗次数所能够达到的最优效果,从而更好的预防内镜生物膜的发生并清除已产生的内镜生物膜。并且为今后的临床内镜再处理实际工作及内镜清洗消毒指南的修订提供可靠的数据支持和理论依据。方法前期调查通过对国内三大内镜售后服务机构集中回收的临床已使用内镜钳子管进行便利抽样,以国内三级医院内镜中心为目标,每家医院收集1条已使用的内镜钳子管送至实验室进行扫描电镜检测,并对该院的内镜清洗消毒负责人发放内镜清洗消毒调查问卷1份。共收集已使用的内镜钳子管10条。对与之匹配的内镜医疗机构同步发放内镜清洗消毒调查问卷10份。将收集的钳子管标本置于25%的戊二醛溶液中固定,经磷酸盐缓冲液冲洗、梯度乙醇脱水等步骤处理后,通过扫描电镜进行生物膜表面微结构的观察。相应的调查问卷维度包括：内镜中心一般情况、内镜清洗情况、内镜消毒情况和清洗消毒相关设施及人力资源配备情况。后期实验通过在内镜钳子管上建立内镜生物膜模型,使用三种不同的内镜清洗刷分别对模型刷洗一次、二次或三次,通过菌落计数及扫描电镜观察内镜生物膜中大肠埃希菌活细菌量及胞外多聚体物质的变化。生物膜模型使用大肠埃希菌菌悬液加入盛有营养肉汤的无菌贮液瓶中混匀,并与内镜钳子管、蠕动泵等连接成密闭循环通路培养系统,37℃电热恒温培养箱中持续灌流培养10天。钳子管内管壁形成成熟生物膜后排空管内灌流液,用无菌手术刀片2厘米为标记分段切开,放入无菌磷酸盐缓冲液中重复冲洗以洗掉浮游菌并吸干液体。采用随机数字表法对分段切开的钳子管进行完全随机化分组。处理因素包括不同的清洗刷和不同的清洗次数。其中不同的清洗刷分为四组,即空白对照组和实验组A(可重复使用清洗毛刷组)、B(一次性管道清洗塑料片刷组)、C(经去酶化处理的软式器械内壁清洁海绵拭棒组)。空白对照组即建模成功后随机选取的4段覆盖有生物膜的测试管用PBS液冲洗。实验组选用的是临床较为常用的一次性或重复性使用内镜清洗刷。遵循临床最为常用的刷洗次数,分别选取刷洗1次、2次和3次,共三个水平。总计12组,每组随机选取4段生物膜测试管,其中3段用于干预后的内镜生物膜内活菌计数测试,另1段用于生物膜表面微结构的扫描电镜观察。实验共重复灌流及干预四次。结果收集的10条内镜钳子管使用年限由0.5-9年不等,其管腔内表面都可见不同程度的裂痕、凹槽或掀起,管腔原有结构均被破坏。扫描电镜观察可见7条钳子管管腔内表面存在有生物膜样组织,其中3条较为严重。高倍镜下见菌体和污物附着在管腔的内表面,其中部分被胞外多聚物基质包覆的生物膜菌体填充,管腔损伤处尤其明显。10所相对应的内镜机构对钳子管道的清洗消毒方法也是各有差异：所有机构都配备有可重复使用的内镜专用清洗毛刷,但刷洗次数和刷洗用水却各有不同；其中90%的机构存在重复使用一次性内镜附件的问题,30%的机构存在不及时更换清洗刷的问题；20%的机构无专职洗消员；内镜清洗消毒的时间也存在差异。不同清洗方法对生物膜实验研究的结果经对数转换后得到标准菌落计数值(1g cfu/cm2)。空白对照组及三种清洗刷刷洗后测定的生物膜平均标准菌落计数(1g cfu/cm2)分别为：14.63、3.36、1.62和10.22。与空白对照组进行比较,B组(塑料片刷)菌量减少>131g cfu/cm2, A组(毛刷)减少>111g cfu/cm2,C组(海绵刷)仅减少<51g cfu/cm2。不同清洗次数的平均标准菌落学计数(1g cfu/cm2)结果为：清洗一次8.32、清洗二次7.00、清洗三次7.06。数据进行析因设计方差分析,不同清洗刷和清洗次数之间存在着交互效应(P=0.042)。进一步进行各个因素的单独效应分析,空白对照组和各实验组之间都有显著性差异(P<0.001),实验组的变量间比较可见毛刷组、塑料片刷组、海绵刷组之间的差异都有统计学意义(P<0.05)。扫描电镜观察,毛刷组与塑料片刷组干预后仅残留部分菌体碎片和少量生物膜基质；而海绵刷组干预后仍残留大片的生物膜和菌体。不同清洗次数变量间比较可见清洗2次或清洗3次对内镜生物膜细菌的清除效果与清洗1次间的差异具有统计学意义(P<0.05)；但是清洗3次与清洗2次之间的统计学差异无意义(P=1.000)。扫描电镜观察显示随着清洗次数的递增,残余的细胞碎片和胞外基质逐渐递减。结论经实验室检测类膜状附着物和生物膜物质的存在说明了目前临床内镜医疗机构的再处理方法尚不够彻底,与文献报道较为一致,为进一步的实验干预提供了理论依据和方向。由于插入内镜附件和清洗刷等对管腔表面的磨损,使得内管腔表面的破损也有助于微生物和分泌物的附着。而内镜清洗消毒方法的差异性、不统一性以及对指南的依从性等,也导致了内镜生物膜的高发生率。三种不同的清洗刷与空白对照组的生物膜细菌总体平均标准菌落计数进行比较,海绵清洗刷对于内镜生物膜细菌的清除效果并不显著,而塑料片清洗刷对内镜生物膜的清除效果明显优于毛刷和海绵刷。对内镜管道重复清洗2次或3次对内镜生物膜细菌的清除效果都比仅清洗1次更为优异,但是重复清洗3次与2次之间的效果无差异。经刷洗后的生物膜完整性均被破坏,生物膜细菌及细菌间胞外基质明显减少,但不同清洗刷的作用效果不一。不同清洗次数之间的比较可见管腔内残留的生物膜逐级递减。证实了不同的内镜清洗刷和不同的清洗次数对于内镜生物膜的清除在不同程度上都有显著作用。