研究背景霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma,HL）是一种好发于儿童和中青年的淋巴造血系统恶性肿瘤,它虽然是恶性淋巴瘤的一部分,但其组织病理学特征与非霍奇金淋巴瘤（non Hodgkin’s lymphoma,NHL）截然不同,其恶性成分--H/RS（Hodgkin/Reed-Sternberg,H/RS）细胞一般只占肿瘤组织的极少部分（＜1%）,其余是大量以淋巴细胞为主的背景细胞,如此少量的H/RS细胞是如何生存于大量的背景细胞之中的?它与背景细胞究竟存在什么关系?H/RS细胞是如何发生的?这些问题170多年来一直困扰着医学界。要探究这些悬而未决的问题,当务之急是建立类似人HL病理特征的淋巴瘤动物模型,观察H/RS细胞与背景细胞之间的相互作用,以揭示H/RS细胞生存、增殖、免疫逃避、免疫调节的机制,这是本课题组多年来在国家自然科学基金资助下一直致力研究的核心问题。最近十几年来有关H/RS细胞的研究取得了很大的进展,研究结果表明H/RS细胞起源于生发中心凋亡前B细胞（残疾B淋巴细胞）。κ基因结合核因子（NF-κB）是调节B细胞分化和存活的重要转录因子,正常状态下NF-κB仅表现为对不同刺激产生一过性活化,但NF-κB在H/RS细胞中则表现为持续活化。NF-κB的持续活化是H/RS细胞显著的分子特征,它能抑制H/RS细胞凋亡,促进其增殖,故NF-κB被认为是H/RS细胞的存活因子。NF-κB属于一个高度保守的转录因子家族,作为重要的转录调控因子,NF-κB调节很多基因表达,这些基因与细胞增殖、分化、免疫反应、凋亡、转化有着密切关系。现已明确HL的发病机制与EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染有关,其潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1,LMP1）通过模拟激活的CD40受体信号而诱导NF-κB的持续活化。LMP1通过活化NF-κB信号传导通路,下调淋巴细胞CD99的表达,可诱导出具有HL病理学特征的H/RS细胞的产生。研究证实,将LMP1基因转染EBV阴性的BJAB细胞和IM9细胞,使CD99蛋白表达减少或缺失的B淋巴细胞显示出了与H/RS细胞类似的表型。本研究组前期将LMP1基因导入小鼠B淋巴瘤细胞株A20细胞后,部分细胞出现了H/RS样细胞的形态特征及免疫表型,初步建立了鼠类人H/RS细胞模型;进一步再利用RNAi技术将A20细胞中的mCD99L2（mouse CD99 antigen-like2）基因沉默,经过在体外反复传代、克隆筛选和鉴定,建立了低表达mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20克隆株,发现其中也出现了类人HL病理学特征的H/RS样细胞。动物体内成瘤实验结果表明,这种低表达mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20克隆株在生物学特性方面与H/RS细胞也具有一定程度的相似性。然而令人遗憾的是,本研究组前期采用传统的脂质体转染法将LMP1基因转染小鼠B淋巴瘤细胞株A20,由于该细胞属于悬浮细胞,转染效率很低,而且所诱导出的H/RS样细胞因在体外培养困难,故未能成功建立长期稳定表达LMP1基因的鼠类人H/RS细胞模型,动物体内成瘤实验也未能成瘤,因而限制了本课题组对HL发病机制研究的开展。目前需要亟待解决的问题是,如何建立长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型?慢病毒载体具有能感染分裂期和非分裂期细胞,使目的基因能在靶细胞内长期稳定表达的优势,而本课题组前期未能成功建立长期稳定表达LMP1基因的鼠类人H/RS细胞模型,本研究拟构建含目的基因LMP1的重组慢病毒表达载体,采用慢病毒转染细胞的技术,将外源基因导入靶细胞A20,在前期课题研究结果的基础之上（LMP1基因导入小鼠B淋巴瘤细胞株A20细胞后,部分细胞出现了H/RS样细胞的形态特征及免疫表型）,建立长期稳定表达LMP1基因的鼠类人H/RS细胞模型。鉴于在EBV阴性的HL细胞株L428表达LMP1后能诱导出更多数量的多核RS细胞的实验研究,以及本课题组前期所建立的低表达mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20克隆株也出现了类人HL病理学特征的H/RS样细胞的形态和免疫表型,本研究拟采用所构建的含目的基因LMP1的慢病毒载体再次转染LV-mCD99L2-A20,观察是否能诱导出更多的多核RS细胞,从而建立长期稳定表达LMP1基因同时低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型。另外,本课题组前期将初步构建的表达LMP1基因的小鼠H/RS样细胞皮下接种BALB/c小鼠未能成瘤,再将低表达mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20克隆株皮下接种具有健全免疫功能的BALB/c小鼠,因成瘤率极低,仅为3.6%（2/56）,显著低于A20细胞在其体内的成瘤率75%（21/28）,使我们在构建鼠类人HL病变特征的动物模型方面遇到了另一个挑战。本研究需要解决的第二个关键问题是:如何提高鼠类人HL病理特征的H/RS样细胞在BALB/c鼠体内的成瘤率?淋巴瘤为免疫系统恶性肿瘤,其发生与机体免疫状况有着密切的关系,研究表明几乎所有HL伴有AIDS患者的H/RS细胞均有EBV的感染,提示HL的发生既与EBV感染密切相关,同时也伴有免疫功能缺陷。本研究拟将BALB/c小鼠经X线照射后,在降低其免疫功能的基础上,将所构建的表达LMP1的A20细胞以及表达LMP1同时低表达mCD99L2的LV-mCD99L2-A20克隆株皮下接种放射后的BALB/c小鼠,提高鼠类人H/RS细胞在BALB/c小鼠体内的成瘤率,观测鼠类人H/RS细胞在BALB/c小鼠体内的生物学特性、免疫表型和病理特征,从而建立鼠类人HL病理特征的动物模型。目的1.构建含目的基因LMP1和报告基因copGFP的重组慢病毒表达载体,进行慢病毒包装和滴度测定。2.不同方式转染鼠源性B淋巴瘤细胞株A20,探讨悬浮细胞A20最佳的转染方式,为本研究后续工作奠定基础。3.将LMP1基因导入A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞,诱导其转化为H/RS样细胞,构建长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型--LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞。4.构建LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20克隆株荷瘤裸鼠模型和BALB/c小鼠模型。方法1.含目的基因LMP1的重组慢病毒表达载体的构建与鉴定以及慢病毒包装和滴度测定根据慢病毒表达载体pCDF1-copGFP的多克隆酶切位点,设计特异性PCR引物,上下游分别引入BglⅡ和EcoRⅠ,以LMP1阳性质粒为模板,扩增目的基因LMP1全长,将之连接到慢病毒表达载体pCDF1-copGFP的多克隆酶切位点,转化大肠杆菌,挑选阳性克隆,经PCR扩增、质粒小量抽提、限制性酶切鉴定和测序鉴定重组载体pCDF1-LMP1-copGFP。在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构质粒pFIV、包膜质粒pVSVG和重组质粒pCDF1-LMP1-copGFP导入病毒包装细胞293FT,收集病毒上清,再用病毒上清转染293FT细胞,荧光显微镜观察293FT细胞绿色荧光的分布,高倍镜下对发荧光的细胞进行计数,根据SBI公司使用手册提供的公式计算病毒上清液的滴度（Tu/ml）:滴度=（稀释因子）×（绿色荧光细胞数/计数的细胞总数）×（被转染的细胞数）/0.5。2.不同方式转染鼠源性B淋巴瘤细胞株A20的探讨分别用传统的脂质体转染技术、新兴发展的Nucleofector^TM核酸转染技术和慢病毒载体介导的转染技术,将重组慢病毒表达载体质粒pCDF1-LMP1-copGFP导入鼠源性B淋巴瘤细胞株A20,荧光显微镜观察A20细胞绿色荧光的分布,高倍镜下对发荧光的细胞进行计数,根据以下公式计算转染效率:转染效率=（绿色荧光细胞数/计数的细胞总数）×100%分析比较这三种技术转染悬浮细胞A20的转染效率,探讨A20细胞最佳的转染方式。3.不同滴度慢病毒转染不同类型细胞转染效率的比较将大容积包装的慢病毒上清液经低温超速离心浓缩,再分别用慢病毒上清液转染293FT、正常鼻咽上皮细胞和A20细胞,以及用浓缩后的慢病毒（10⁷Tu/ml）分别转染293FT、L428和A20细胞,转染5d后,荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光的分布,比较分析不同滴度慢病毒转染不同类型细胞的转染效率。4.长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型的构建与鉴定采用经大容量包装和低温超速离心浓缩后的含目的基因LMP1的慢病毒转染A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞,有限稀释法筛选LMP1⁺A20单克隆和LMP1⁺/mCD99L2^-A20单克隆细胞。光学显微镜和透射电镜下观察LMP1⁺A20单克隆和LMP1⁺/mCD99L2^-A20单克隆细胞的形态特征;光镜下测试网格计数法动态监测大细胞（直径≥25μm）。RT-PCR和Western blot分别检测细胞内LMP1mRNA和LMP1蛋白的表达;MTT法检测细胞体外增殖能力;Transwell检测细胞的微侵袭能力;流式细胞仪检测细胞周期及细胞的免疫表型（CD19与CD30）。PCR检测LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞内shRNA干扰载体的整合情况;RT-PCR及荧光定量PCR检测LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞内mCD99L2表达水平。5.LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20克隆株荷瘤裸鼠和BALB/c小鼠模型构建分别将LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20克隆株皮下接种裸鼠成瘤,观察动物成瘤时间、成瘤率、皮下肿瘤生长速度;取裸鼠瘤块行石蜡包埋、制备病理组织切片、HE染色观察瘤细胞形态;免疫组织化学染色检测瘤组织内LMP1蛋白的表达;取瘤组织做原代培养,RT-PCR检测原代细胞内LMP1mRNA的表达;RT-PCR检测mCD99L2的表达水平;流式细胞仪检测原代瘤细胞CD19和CD30的表达。再分别将LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20克隆株皮下接种娇档暮途璛线照射（2Gy）后的同源BALB/c小鼠,做上述检测和鉴定;流式细胞仪检测正常BALB/c小鼠、接种瘤细胞成瘤和未成瘤小鼠外周血中淋巴细胞亚群的比例。6.统计学处理采用统计软件SPSS 13.0对实验结果进行统计学处理和分析。计量资料以均数±标准差（x^-±s）表示。MTT法检测体外细胞增殖能力采用析因设计方差分析比较各组间差异。A20与各组细胞中H/RS样细胞数目的比较采用两因素方差分析（two-wayANOVA）比较组间差异。流式细胞仪检测细胞周期、肿瘤细胞CD抗原表达、外周血淋巴细胞亚群比例数据采用单因素方差分析（One-wayANOVA）比较组间差异,LSD多重比较各组间差异。Transwell法检测细胞体外微侵袭能力和两组之间成瘤时间的比较采用两独立样本t检验进行比较,两组之间成瘤率的比较采用X²检验。在体肿瘤生长曲线的比较采用重复测量方差分析方法处理,若球形检验P＜0.05,拒绝球形检验,用Greenhouse-Geisser进行校正,采用校正后的F值和P值。结果1.含目的基因LMP1的重组慢病毒表达载体的构建与鉴定以及慢病毒包装和滴度测定（1）PCR扩增目的基因LMP1所设计引物位于LMP1全外显子的上下游,包含起始密码子和终止密码子,扩增片段大小为1.2 kb。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳见一清晰的特异性扩增条带,其大小与理论预期值相符。（2）LMP1基因重组慢病毒表达载体pCDF1-LMP1-copGFP的构建和鉴定将构建的LMP1基因重组慢病毒表达载体pCDF1-LMP1-copGFP的菌液经PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳可见1.2 kb的目的基因LMP1片段,小量抽提重组质粒,经EcoRⅠ和BglⅡ双酶切后,获得与目的基因LMP1 1.2kb一致的清晰条带,而空载体质粒上只有6671 bp的单一片段。（3）DNA测序结果取重组质粒进行DNA测序,结果表明我们所获得的LMP1片段与GenBank所公布的相应序列一致,无碱基缺失及错误。（4）慢病毒包装及滴度测定结果用脂质体将已构建的慢病毒载体系统中3种质粒成分导入病毒包装细胞293FT中,荧光显微镜下见大量绿色荧光,证实已有大量质粒转入293FT细胞,绿色荧光位于细胞的胞膜及胞浆,这与LMP1的表达位置一致。取病毒上清液转染293FT细胞,荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光的分布,测定病毒上清液的滴度为1.6×10⁵Tu/ml。2.不同方式转染鼠源性B淋巴瘤细胞株A20（1）脂质体转染通过阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000介导,将重组质粒pCDF1-LMP1-copGFP导入A20细胞,转染24～48h后,荧光显微镜下观察仅见个别细胞有绿色荧光。（2）Nucleofector^TM核酸转染采用Amaxa核酸转染仪,将特定的转染溶液Nucleofector^TM和重组质粒pCDF1-LMP1-copGFP导入A20细胞,转染4～48h后,荧光显微镜下观察可见较多细胞有绿色荧光,转染效率在10%左右,表明Nucleofector^TM核酸转染技术可明显提高A20细胞的转染效率。但是,转染72h后几乎不见绿色荧光细胞,并且细胞死亡率逐渐提高。（3）慢病毒上清液转染用含目的基因LMP1的慢病毒上清液转染293FT、正常鼻咽上皮和A20细胞,转染5d后,荧光显微镜下观察,293FT和鼻咽上皮细胞可见较多的绿色荧光,转染效率约为80%,而A20细胞则有少许细胞有绿色荧光,转染效率＜1%。3.浓缩后的慢病毒转染不同类型细胞转染效率的比较用经过大容积包装和低温超速离心浓缩后的慢病毒（滴度为10⁷Tu/ml）分别转染293FT、L428和A20细胞,其转染效率分别为100%、90%和80%。4.长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的鼠类人H/RS细胞模型的构建与鉴定（1）采用经低温超速离心浓缩后的含目的基因LMP1的慢病毒分别转染A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞,有限稀释法筛选出LMP1⁺A20细胞单克隆株和LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞单克隆株。转染25d后,倒置显微镜和普通光学显微镜观察,发现细胞出现明显的形态改变,细胞体积增大,直径≥25μm,胞浆丰富,细胞核及核仁明显增大,出现单核、双核和多核H/RS样细胞。（2）透射电镜观察,转型后的LMP1⁺A20细胞体积增大,胞浆丰富,细胞器增多,主要表现为线粒体和内质网增多。最明显的是细胞核增大,核仁明显增大,出现多核和双核细胞。（3）细胞计数结果经两因素方差分析显示,不同细胞组之间差异具有显著性（F=529.733,P=0.000）,三组细胞经LSD多重比较显示,LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞中H/RS样细胞与对照组A20细胞相比,差异具有显著性（P=0.000）,LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞中H/RS样细胞数目较A20细胞中的H/RS样细胞多;而LMP1⁺A20与LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞中H/RS样细胞数无统计学差异。（4）RT-PCR检测LMP1⁺A20细胞和LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞内LMP1mRNA表达阳性,而对照组A20细胞表达阴性。（5）Western blot检测LMP1⁺A20细胞内LMP1蛋白表达阳性,而空载体组pCDF-A20细胞和对照组A20细胞表达阴性。（6）MTT检测发现LMP1⁺A20细胞体外增殖能力较空载体组pCDF-A20细胞和对照组A20细胞减慢,差异有显著性（P＜0.05）。（7）Transwell法检测细胞体外微侵袭能力,发现LMP1⁺A20细胞的运动能力比pCDF-A20细胞明显减慢,差异具有显著性（P=0.000）。（8）流式细胞仪检测细胞周期发现LMP1⁺A20、pCDF-A20与A20细胞G1期和S期比例无显著性差异,LSD多重比较结果显示:LMP1⁺A20细胞G₂期比例高于pCDF-A20组和A20组,差异有显著性（P=0.010）。pCDF-A20组与A20组G₂期差异不显著（P=0.966）。（9）流式细胞仪检测细胞的免疫表型,单因素方差分析显示LMP1⁺A20、pCDF-A20与A20三组细胞CD30阳性细胞比例有显著性差异（F=326.125,P=0.000）,CD19阳性细胞比例无显著性差异（F=4.473,P=0.650）。LSD多重比较结果显示LMP1⁺A20细胞CD30阳性细胞比例（72.600±1.990%）高于对照组A20细胞（41.173±1.620%）和pCDF-A20细胞（41.587±1.543%）,差异有显著性（P=0.000,P=0.000）。（10）抽提LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞DNA进行PCR,能检测出ShRNA干扰载体稳定整合至细胞基因组。（11）RT-PCR及荧光定量PCR检测LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞mCD99L2的表达水平低于A20细胞,mCD99L2基因的干扰效率约为50%。5.LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20克隆株荷瘤裸鼠模型的构建与鉴定（1）成瘤情况:LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20克隆株2×10⁷细胞分别皮下接种裸鼠3只（6个位点）,成瘤率100%,成瘤时间分别为9.5±2.9d和10.5±1.4d。（2）病理形态观察:光镜下见瘤细胞弥漫分布,大小不一,细胞核大深染,核圆形、卵圆形或不规则形,病理性核分裂像多见;LMP1⁺A20克隆株和LMP1⁺/mCD99L2^-A20克隆株均可见散在分布的胞浆丰富的大细胞,呈双核、多核或不规则核,核仁大,微嗜酸性。这些大细胞极其类似人HL的H/RS细胞形态。（3）免疫组织化学染色:瘤组织内LMP1蛋白表达阳性,阳性定位于细胞膜。（4）取瘤组织做原代培养,RT-PCR检测原代瘤细胞内LMP1mRNA的表达,琼脂糖凝胶电泳可见1.2kb片段;（5）RT-PCR检测LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞内mCD99L2的表达水平,低于对照组A20细胞。（6）流式细胞仪检测LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20原代瘤细胞CD19和CD30的比例分别为83.6%、52.5%和87.1%、61.2%。6.LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20克隆株BALB/c小鼠模型的建立（1）成瘤情况:LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20克隆株2×10⁷细胞分别皮下接种BALB/c小鼠,两株细胞未照射组（n=4）均未成瘤;照射后24h组（n=4）接种LMP1⁺A20细胞成瘤率为100%,接种LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞成瘤率为75%。结果表明将两组瘤细胞接种未经照射的BALB/c小鼠,均未见肿瘤形成,而X线全身照射（2Gy）BALB/c小鼠后24h接种瘤细胞则能显著提高成瘤率。（2）病理形态观察:光镜下见瘤细胞弥漫分布,大小不一,细胞核大深染,核圆形、卵圆形或不规则形,可见散在的胞浆丰富的大细胞,呈双核、多核或不规则核,核仁大,微嗜酸性,其中可见“镜影细胞”,在肿瘤细胞周围可见淋巴细胞呈散在或灶性浸润,另还可见浆细胞和组织细胞等背景细胞。（3）免疫组织化学染色:检测瘤组织内瘤细胞LMP1表达阳性,定位于细胞膜和细胞浆。（4）RT-PCR检测原代瘤细胞内LMP1 mRNA的表达,可见1.2kb片段;（5）RT-PCR检测LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞内mCD99L2的表达水平,低于对照组A20细胞。（6）外周血淋巴细胞亚群:对接种LMP1⁺A20细胞和LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞成瘤和未成瘤的BALB/c小鼠外周血进行流式细胞检测CD3、CD4、CD8、CD19阳性淋巴细胞亚群的比例,并与正常BALB/c小鼠（n=4）进行比较。方差分析显示五组间各指标均存在显著性差异。LSD多重比较显示:接种LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞成瘤鼠和未成瘤鼠间CD3（P=0.000）、CD4（P=0.000）、CD8（P=0.000）、CDl9（P=0.000）阳性细胞比例有显著性差异;成瘤鼠CD3、CD4、CD8低于未成瘤鼠,CD19高于未成瘤鼠,而接种LMP1⁺A20细胞成瘤鼠和接种LMP1⁺/mCD99L2^-A20细胞成瘤鼠间CD3、CD4、CD8、CD19阳性细胞比例无显著性差异。结论1.高滴度慢病毒表达载体可高效转染小鼠B淋巴瘤细胞A20,较脂质体转染法和Nucleofector^TM核酸转染法有明显的优势。2.将LMP1基因导入A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞,能诱导A20细胞转化为H/RS样细胞,建立了长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的小鼠H/RS样细胞模型。3.将LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20克隆株分别皮下接种裸鼠和经X线照射后的BALB/c小鼠,建立了LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20克隆株荷瘤裸鼠模型和BALB/c小鼠模型,后者出现了淋巴细胞、浆细胞和组织细胞等背景细胞,类似人cHL的病理特征。创新之处1.探索出了一种高效转染悬浮细胞A20的方法--高滴度慢病毒转染法。2.将LMP1基因导入A20细胞和LV-mCD99L2-A20细胞,建立了长期稳定表达LMP1基因和/或低表达mCD99L2基因的小鼠H/RS样细胞模型。3.将LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20克隆株分别皮下接种裸鼠和经放射后的BALB/c小鼠,建立了LMP1⁺A20和LMP1⁺/mCD99L2^-A20克隆株荷瘤裸鼠模型和BALB/c小鼠模型,后者出现了类似人cHL的病理特征,初步建立了类人HL小鼠模型。4.X线照射BALB/c小鼠（2Gy）降低其免疫功能后,便于建立荷瘤动物模型。