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多粘菌素被称为是临床防治多重耐药革兰阴性菌的最后一道防线,由质粒介导的耐药基因mcr-1(mobile colistin resistance,mcr)的发现使针对多粘菌素耐药基因的研究成为当下的热点。为进一步完善广州和中山地区细菌多粘菌素的耐药基因谱,本研究以广州市某三甲医院的临床分离革兰阴性菌、中山市某些肉菜市场生鲜肉中的奇异变形杆菌和中山市某些猪场的猪源及环境中的奇异变形杆菌为对象,研究耐药表型,检测多粘菌素耐药基因并研究耐药基因的可转移性。使用全自动微生物鉴定与药敏系统和一些辅助实验对临床分离株进行鉴定与药敏实验,得到临床分离革兰阴性菌,并对相关结果统计分析。煮沸法对研究菌株进行基因组DNA的提取。采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测多粘菌素耐药基因,将检测结果阳性的PCR产物送出测序验证,保证PCR结果的真实性。依照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)制定的标准采用Kirby-Bauer(K-B)纸片扩散法和肉汤稀释法进行药物敏感性实验,研究菌株的耐药表型。进行质粒接合转移实验等,研究耐药基因的可转移性。采用肠杆菌科间重复序列ERIC(Entrobacter repetive intergenic consensus,ERIC)-PCR法对阳性菌株进行分型,研究其亲缘关系。结果如下:(1)共收集到临床分离革兰阴性菌1190株,分别是:363株铜绿假单胞菌、221株大肠埃希菌、206株鲍曼不动杆菌、204株肺炎克雷伯菌、75株奇异变形杆菌和其他类别的121株菌。根据菌种进行相应的药敏实验,药敏结果显示耐药情况不严重。(2)1190株临床分离株中检测到1株携带mcr-1的大肠埃希菌5798,未检测到携带mcr-2、mcr-3、mcr-4和mcr-5的菌株;1114株肉菜市场生鲜肉、猪场的猪源及环境中的奇异变形杆菌中检测到9株携带mcr-1的菌株:1DM18b、1acx3a、1acx46a、1bcm6b、1ccx14b、1Y33a、1acD2a、19Pb和10Cb。(3)10株携带mcr-1的菌株都耐3类及以上的抗菌药物,耐药情况严重。5798对多粘菌素B(Polymyxin B,PLB)和多粘菌素E(Colistin,COL,黏菌素)都敏感,1acx3a、1bcm6b、1acD2a和19Pb对PLB和COL都不耐药,其余5株对PLB和COL都耐药。(4)携带mcr-1的临床分离大肠埃希菌接合成功并提出质粒,质粒大小大于15 kb。9株携带mcr-1的奇异变形杆菌未接合成功,1acx46a、1bcm6b和1ccx14b提到的质粒大小大于15 kb,1acD2a、1Y33a、1DM18b和19Pb提得的质粒大小约为15 kb,10Cb提得的质粒大小在2.5 kb以下,1acx3a多次提取均未提取到质粒。经验证,5798、1acD2a、1DM18b、19Pb和1ccx14b的耐药基因位于提取的质粒上,1acx46a、1acx3a、1bcm6b、1Y33a和10Cb的耐药基因位于染色体上。(5)10株携带mcr-1的菌株分型成功,相似值为0.5-0.85。相似性为75%以上可划分为A-G共7个簇,相似性90%以上的可判定为同一基因型,在此次分型中未发现同一个基因型的菌株。综上所述,本次研究中分离到的1190株临床致病菌耐药情况不严重。多粘菌素耐药基因的检出率很低,但这10株携带mcr-1的菌株耐药情况严重。5株菌株的mcr-1位于质粒上,5株位于染色体上。10株携带mcr-1菌株的基因型都不相同。通过本论文的研究,进一步完善了广东地区细菌多粘菌素耐药基因谱,药敏结果为抗菌药物的使用和菌株耐药监测提供了科学的参考依据。