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研究背景:结肠癌的发病在国内外逐渐增多,尽管其辅助化疗取得了一定进展,但目前使用的化疗药物仍缺乏理想的治疗效果且毒副作用较大。因此,从传统中药中分离有效活性成分研发具有抗癌活性的新型药物已成为一种新的趋势。雷公藤甲素(triptolide,TP)作为临床常用传统中药雷公藤(GTW)中免疫调节功能最强的单体,药理作用广泛,临床上用于免疫调节及抗炎的治疗。近年研究发现TP抗肿瘤作用突出,但其抗癌机制尚不十分明确。目的:探讨TP对人结肠癌HCT116细胞增殖的影响,从细胞周期、细胞凋亡和细胞自噬三方面探究TP抗结肠癌治疗可能的作用机制,为结肠癌的临床治疗提供新方向,为中药单体抗结肠癌治疗提供理论依据。方法:1.TP对HCT116细胞的影响:(1)应用MTT法确定TP对HCT116细胞增殖的抑制作用及有效浓度;(2)应用流式细胞术(FCM)检测TP对HCT116细胞周期与凋亡的影响;(3)应用DAPI染色和MDC染色检测TP对HCT116细胞形态学的影响;(4)应用Western blot(WB)检测HCT116细胞中周期相关蛋白、凋亡信号通路相关蛋白和自噬分子标记物表达水平;(5)应用泛凋亡抑制剂联合TP干预HCT116细胞,流式细胞术检测其对TP诱导的HCT116细胞凋亡的影响。2.TP诱导HCT116细胞凋亡与自噬间的作用关系研究:(1)应用泛凋亡抑制剂z-VAD-FMK联合TP处理HCT116细胞,设置对照组、TP组、TP+z-VAD-FMK组与z-VAD-FMK组,用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率的变化;(2)应用自噬抑制剂3-MA联合TP处理HCT116细胞,设置对照组、TP组、TP+3-MA组与3-MA组,用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率的变化;(3)应用自噬诱导剂RAPA联合TP处理HCT116细胞,设置对照组、TP组、TP+RAPA组、RAPA组,用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率的变化。结果:(1)TP对HCT116细胞增殖和细胞周期的影响:TP显著降低HCT116细胞存活率,抑制其增殖,并呈浓度、时间依赖性;TP可以诱导HCT116细胞S期阻滞,并抑制周期蛋白CDK4、CyclinD1的表达。(2)TP对HCT116细胞凋亡的影响及机制:TP可呈浓度依赖方式诱导HCT116细胞凋亡;TP可下调HCT116细胞中Caspase3、Caspase9和Bcl2蛋白的表达,并呈浓度依赖性,但TP可上调HCT116细胞中cleaved Caspase3、cleaved Caspase9的表达;TP对Caspase8的表达无影响;TP还可促进HCT116细胞中Bax向线粒体内转移、促进Cytochrome c向细胞质中转移。(3)TP对HCT116细胞自噬的影响:TP促进HCT116细胞中自噬囊泡的产生;上调自噬相关蛋白LC3的表达,并且呈浓度、时间依赖性。(4)TP诱导HCT116细胞凋亡与自噬间的相互关系:与TP组相比,自噬诱导剂(RAPA)联合TP组细胞凋亡率显著增高,自噬抑制剂(3-MA)以及泛凋亡抑制剂(z-VAD-FMK)联合TP组细胞凋亡率都明显降低。结论:(1)TP可抑制人结肠癌HCT116细胞的增殖和存活,其机制可能是TP诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡;(2)TP可经线粒体途经诱导HCT116细胞凋亡;(3)TP可诱导HCT116细胞产生自噬,同时,自噬可促进TP诱导的细胞凋亡。