背景:肺癌是世界上发病率和死亡率增长最快,对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一,在男性中其死亡率和发病率均位居首位。目前,针对肺癌的治疗方案主要有放疗,化疗和分子靶向治疗。新世纪以来,靶向治疗发展迅猛,广泛地使用靶向治疗手段使得患者的生存期得到显著地延长。而靶向治疗的前提是需要了解肿瘤的分子生物学信息,目前基因检测的样本主要来源于组织活检。但有时候活检的组织未必能够满足繁杂的基因检测的要求,特别是肺癌患者通常具有多个基因的突变。人体循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)作为来源于肿瘤细胞的DNA,具有与肿瘤组织一致的遗传信息,被认为是组织活检的最好的替代品。但是ctDNA在血液中的含量很少,通常只占血液游离DNA(cell free DNA,cfDNA)的1%左右,所以对ctDNA的检测一定要选用高精度的检测手段。下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)具有高通量,高精度,高深度的特点,非常适合应用于ctDNA的检测。本文目的是构建一个基于高通量测序技术检测肺癌外周血ctDNA的方法,并应用到临床肺癌外周血ctDNA的检测,从而获取肿瘤的分子生物学信息,并希望能为临床的靶向治疗提供帮助。方法:1,通过文献查阅,设计一个覆盖多个肺癌驱动基因核苷酸序列片段的多重PCR引物。2,以含有不同突变频率核苷酸的cfDNA参考标准品为样本,使用高通量测序技术靶向测序标准品样本,建立高通量测序技术检测ctDNA质量控制标准体系。3,以10例已知基因突变信息的肺癌临床ctDNA为样本,使用高通量测序技术进行靶向测序,测序的质控结果需符合上述建立的标准。使用数字PCR技术验证高通量测序结果。4,运用高通量测序技术检测74例肺癌ctDNA样本,并对测序结果进行统计,分析突变基因的检出率是否跟肿瘤类型、肿瘤分期、转移相关,分析ctDNA对肿瘤化疗疗效的评估作用结果:1,高通量测序技术检测cfDNA参考标准品结果显示,当测序深度达到12,000 X及以上时,所有的0.1%的突变核苷酸都能够被检测出来,根据这个参考标准品测序结果,建立了高通量测序检测ctDNA的质量控制标准。2,高通量测序检测10例肺癌ctDNA样本结果显示,有5例的检测结果为阳性,有5例为阴性,与组织检测结果的一致性为70%(7/10),特异性为100%(2/2),灵敏度为62.5%(5/8)。数字PCR的检测结果与高通量测序结果一致性达到了90%(8/9)。3,高通量测序检测74例肺癌ctDNA样本结果显示,有8个基因的36种突变被检测出来,其中TP53基因突变检出率最高,达到了52.7%。对检测结果进行统计分析发现,各个基因的检出率与肿瘤的分期和转移无关。在非小细胞肺癌中,EGFR基因突变在肺鳞癌中检出率较鳞状细胞癌中要高。结论:综上所述,我们成功建立了高通量测序技术检测肺癌ctDNA样本的方法。并将该方法成功地应用于临床肺癌ctDNA样本的检测中去,并通过统计学分析,发现肺癌驱动基因与肺癌肿瘤类型,肺癌病理分期肺癌及转移的关系,并利用ctDNA检测结果对化疗疗效进行了初步的评估。