麦麸酯酶抑制法检测果蔬中有机磷及氨基甲酸酯类农药的研究

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农产品中的农药残留问题已越来越引起各国政府和公众的关注,因此必须对农药使用加以控制,加强农药残留的检测力度。酶抑制法快速检测农药残留技术对所测样品的前处理要求简单、成本低、检测时间短,非常适合我国小规模、分散的销售体系中经常性的现场快速检测,而且由于植物酯酶来源广、成本低、提取方便、易保存等优点,引起许多学者的关注,以期能替代乙酰胆碱酯酶。麦麸是小麦加工的副产物,产量约占小麦加工量的20%,来源更广、价格更低廉。本研究以麦麸为原料提取麦麸酯酶,探索了麦麸酯酶纯化前后对有机磷和氨基甲酸酯类农药的敏感性及动力学常数,并对检测方法中前处理的优化、假阳性的消除进行研究。主要研究结果如下:1.通过比色法研究了酶抑制法检测农残时表面活性剂对固蓝B盐显色体系的增敏作用及农药最佳抑制时间。结果表明:以阴离子表面活性剂SDS作为增敏剂,在吸收波长535nm处检测,可使反应体系相对吸光度值增加了152.76%。在酶活抑制率测定时除叶蝉散外,其余5种农药对麦麸酯酶的最佳抑制时间为30min,而叶蝉散最佳抑制时间为40min。2.在酶抑制法最佳检测体系下以酶活抑制率为指标,分别研究了纯化前后的麦麸酯酶对6种农药的敏感性及最低检测限。结果显示:未经纯化的麦麸酯酶对6种农药的最低检测限范围是0.006~0.45mg/L,与GB2763-2014规定的最大残留量相比,除甲基对硫磷之外,均可满足对敌敌畏、乐果、叶蝉散、丁硫克百威、西维因5种农药的检测要求。而经过凝胶层析后的麦麸酯酶对6种农药的最低检测限范围是0.003~0.193mg/L,其灵敏度比粗酶液提高了1.1~2.3倍。经过双水相萃取的麦麸酯酶对6种农药的最低检测限范围是0.005~0.116mg/L,其灵敏度比粗酶液提高了1.35~2.2倍。而经过硫酸铵盐析后的麦麸酯酶对6种农药的最低检测限范围是0.039~0.386mg/L,该麦麸酯酶对农药的敏感性明显低于未经纯化的麦麸酯酶。3.通过双分子反应速率常数的测定方法,利用可见分光光度计测定了6种农药抑制麦麸酯酶动力学常数(Ki、Ka、K2)及IC50值。比较动力学常数及IC50值发现,各农药对麦麸酯酶的抑制作用存在不同程度的选择性,且由动力学常数所反映出的农药对麦麸酯酶的抑制作用大小与农药对粗酶敏感性的研究结果相一致。即6种农药对麦麸酯酶粗酶的敏感性大小依次为敌敌畏>叶蝉散>西维因>丁硫克百威>甲基对硫磷>乐果。4.利用未经纯化的麦麸酯酶,在最佳酶活抑制率测定的基础上以加标回收率为指标,对酶抑制法快速检测农残前处理方法中农残提取液、提取方法、提取时间及样品提取液的处理方式进行优化。结果表明,在不影响酶活的前提下用5%丙酮-磷酸盐缓冲液作为提取液,然后超声提取5 min后,将样品提取液再用0.45 gm有机滤膜过滤后蔬菜中农药残留提取量可达到最高。且样品加标回收率为83.61%~102.81%,变异系数为1.20%~7.23%,因此该前处理方法可满足于麦麸酯酶抑制法快速检测农药残留的需要。5.以酶活抑制率为指标,采用不同的加热处理方式研究消除4种辛辣蔬菜检测中的假阳性。结果表明,对样品提取液使用水浴加热可起到消除假阳性的作用。小葱、洋葱、大蒜和青椒的最佳水浴加热温度分别为80℃、90℃、80℃和80℃,经过处理后的样品提取液对麦麸酯酶的抑制率分别由原来的37.06%、9.65%、17.02%、50.34%下降到12.69%、2.95%、5.79%和33.61%。除青椒外该方法可在一定程度上消除或大大的降低植物酶抑制法中假阳性的影响,且不会造成农药残留的损失,从而提高酶抑制法对辛辣蔬菜快速检测的准确性。
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