论文部分内容阅读
金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌是水产品中重要的食源性致病菌之一，严重危害水产品的质量安全，易引发食源性食物中毒；由金黄色葡萄球菌产生的肠毒素及单增李斯特菌形成的生物被膜同样具有巨大的潜在危害，金黄色葡萄球菌引发的食物中毒中有95%是由其肠毒素引起的，生物被膜极易造成食品污染。这严重威胁人们的身体健康并会对海产行业造成巨大的经济损失。纳豆菌抗菌肽是由中国传统食品纳豆中分离的一株纳豆菌发酵产生的一种抗菌脂肽，它具有广谱抗菌活性，对热稳定，且水溶性好，安全无毒无副作用，是一种新型的天然生物制剂。据此，本论文主要研究纳豆菌抗菌肽对金黄色葡萄球菌及其产肠毒素B、单增李斯特菌及其生物被膜的控制效应以及建立对虾中纳豆菌抗菌肽对金黄色葡萄球菌生长及其产肠毒素B、单增李斯特菌生长的控制模型，旨在为金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的危害控制提供新方法，为纳豆菌抗菌肽应用于水产品提供理论依据。得到以下研究结果：1.通过牛津杯法和液体二倍稀释法测定纳豆菌抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌活性，并采用细菌菌落计数和金葡菌肠毒素B免疫磁珠试剂盒分别检测不同浓度纳豆菌抗菌肽以及在菌不同生长时期加入纳豆菌抗菌肽金黄色葡萄球菌的生长及肠毒素B的量，研究其控制效应。结果表明：纳豆菌抗菌肽对金黄色葡萄球菌有很好的抑菌效果，其MIC和MBC分别为1.25mg/mL、5mg/mL；当于培养初期加入纳豆菌抗菌肽浓度达到1MIC时金黄色葡萄球菌菌体总量与肠毒素B的量得到了控制；在金黄色葡萄球菌菌体浓度低时加入纳豆菌抗菌肽比其菌体浓度高时控制效果好；并且在金黄色葡萄球菌指数生长期加入纳豆菌抗菌肽比在延滞期加入对其菌体的控制效果明显，但毒素的量会有所增加。因此，为了有效控制肠毒素的产生，抗菌肽应该在生长初始阶段加入。2.研究了对虾中纳豆菌抗菌肽对金黄色葡萄球菌生长及其产肠毒素B的控制，对其结果采用Origin8.5软件中Logistic、Gompertz、Richards方程进行拟合，建立纳豆菌抗菌肽对金黄色葡萄球菌生长和其产肠毒素B的控制模型。结果表明：纳豆菌抗菌肽能延迟金黄色葡萄球菌的延滞期，降低其生长速率，能够有效的控制对虾中金黄色葡萄球菌的生长。不同浓度纳豆菌抗菌肽对金黄色葡萄球菌生长的最适控制模型是Logistic模型。肠毒素B的最适控制模型是：当纳豆菌抗菌肽浓度为2MIC、0.5MIC时，Gompertz模型为最适模型；纳豆菌抗菌肽浓度为1MIC、0.25MIC时，最适控制模型分别Logistic模型、Richards模型。其拟合曲线的R2值均大于0.9，说明建立的模型能够较好地预测纳豆菌抗菌肽对金黄色葡萄球菌及其产肠毒素B的控制规律。3.建立多种因素的共同作用下纳豆菌抗菌肽杀灭虾肉中金黄色葡萄球菌及其产肠毒素B的抑菌数学模型，并考察纳豆菌抗菌肽在虾产品使用中的影响因素。通过响应面设计对影响纳豆菌抗菌肽使用的可能的主要因素盐度、温度、pH和焦亚硫酸钠进行了筛选，并用Design-Expert软件进行回归拟合，建立多因素条件下的抑菌数学模型。结果发现温度、盐度、pH和焦亚硫酸钠对纳豆菌抗菌肽的抗菌活性均没有显著的交互影响；建立了二次多项数学模型，得到在一定范围内金黄色葡萄球菌菌落数预测值（Lg N）、肠毒素B（Y）对编码自变量x1（温度）、x2（氯化钠浓度）、x3（pH）、x4（焦亚硫酸钠浓度）、x5（AMPNT-6浓度）的二次多项回归方程：Lg N=6.93+0.29x1-0.11x3-0.46x5-0.35x12-0.30x3x4（R2=0.9049）Y=22.83+4.33x1-6.02x5-5.28x12-4.68x1x4-3.80x3x4（R2=0.8874）该模型拟合度好，可用于多因素条件下对虾中金黄色葡萄球菌及其产肠毒素B的控制预测。4.研究了不同浓度纳豆菌抗菌肽对单增李斯特菌的控制效应以及对单增李斯特菌生物被膜的抗粘附、清除作用。结果表明，纳豆菌抗菌肽对单增李斯特菌有很好的抑菌、杀菌效果，其MIC和MBC分别为0.625、1.875mg/mL；当于培养初期加入终浓度为1MIC的纳豆菌抗菌肽即可抑制其生长，且从杀菌动力学曲线中可看出在2.5h杀灭了36%的菌体。终浓度达到2MIC时，在27h内菌数降低了4个数量级；在培养初始阶段以及在菌体低浓度时加入纳豆菌抗菌肽控制效果更明显。纳豆菌抗菌肽对单增李斯特菌生物被膜有很好的抗粘附、清除作用。当于培养初期加入纳豆菌抗菌肽的浓度达到2MIC时可控制生物被膜的形成，并且在生物被膜形成的过程中加入纳豆菌抗菌肽以及纳豆菌抗菌肽先作用与微孔后都有抗粘附作用，不同浓度的纳豆菌抗菌肽对生物被膜有显著的清除作用，8h后生物被膜的量便维持在相对最低的水平。由扫描电镜观察到当纳豆菌抗菌肽的浓度为1MIC时，不锈钢片上无被膜组织。5.通过Origin8.5软件中Logistic、Gompertz、Richards方程进行拟合，建立对虾中纳豆菌抗菌肽对单增李斯特菌的控制模型。并采用Design-Expert软件中响应面设计对可能影响对虾中纳豆菌抗菌肽抗菌活性的主要因素盐度、温度、pH和焦亚硫酸钠进行了筛选，并对结果进行回归拟合，建立多因素条件下纳豆菌抗菌肽杀灭虾肉中单增李斯特菌的抑菌数学模型。结果表明：纳豆菌抗菌肽对单增李斯特菌生长的最适控制模型是Logistic模型。纳豆菌抗菌肽能延迟单增李斯特菌的延滞期，降低其生长速率，能够有效的控制对虾中单增李斯特菌的生长。纳豆菌抗菌肽与温度、盐度、pH和焦亚硫酸钠的无显著交互影响。采用响应面法建立了二次多项数学模型，得到在一定范围内单增李斯特菌落数预测值（Lg N）对编码自变量x1（温度）、x2（氯化钠浓度）、x3（pH）、x4（焦亚硫酸钠浓度）、x5（AMPNT-6浓度）的二次多项回归方程：Lg N=7.42+0.28x1-0.12x3-0.47x5-0.17x12+0.21x52-0.23x1x2（R2=0.9126）其拟合曲线的R2值均大于0.9，说明建立的模型能够较好地预测纳豆菌抗菌肽对单增李斯特菌的控制规律，可用于对虾中单增李斯特菌的控制预测。