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刺参(Apostichopus japonicus)隶属于棘皮动物门(Echinodermata)、海参纲(Holothuroidea),是我国海洋水产养殖的主要品种之一。而近年来北方沿海养殖的刺参不断暴发大规模的刺参溃疡病,给刺参养殖业造成了巨大的损失,本论文围绕刺参疾病的发生、刺参溃疡病病原及其致病性并进而寻找防治疾病的方法,进行了较系统的研究。
2004年在山东省莱州市的刺参养殖场,对各发育阶段的发病刺参进行取样,从病变部位分离出细菌,优势菌种经纯化后对健康的养殖刺参进行回归感染实验,进而证明该菌的致病性。然后,对该病原菌进行形态学观察、研究其在刺参体内的病变情况、病原菌的生理生化鉴定及其分子分类学地位研究和抗菌药物实验等。
刺参溃疡病可以使刺参从症状出现的三天内死亡,这种病的原发性症状是在口、肛门、创伤部位出现白色的斑点,而后斑点迅速扩大至全身,引起刺参的死亡。通过显微镜观察石蜡切片发现严重的病变发生在刺参组织内,发病刺参皮肤完全被破坏,并有向周围组织扩散的趋势;在电镜切片中发现大量短杆状细菌,发病刺参组织所制作的切片易破碎。
细菌在30℃培养36小时后,菌落较小,大小约2—4mm,菌落颜色呈白色或淡黄色,菌落表面光滑湿润,稍有粘性,无气味,不透明,菌落中央顶部较平坦,中央颜色较深,菌落呈凸型。经过细菌负染色发现的细菌形态和切片中相似,短杆状,极生单鞭毛,大小约为0.5—0.7μm×1—1.5μm左右,细菌呈椭圆形,不产芽孢,革兰氏染色结果为阴性(G—)。
通过细菌生化鉴定初步确定为假单胞菌,呈现阳性的生化指标有:氧化酶、果糖、葡萄糖酸盐、覃糖、精氨酸双水解酶、精氨酸、尿素、七叶灵、苯丙氨酸、硝酸盐还原;呈现阴性的生化指标有:麦芽糖、西蒙氏枸橼酸盐、葡萄糖、赖氨酸、水杨素、半固体、侧金盏花醇、ONPG、卫矛醇、蜜二糖、淀粉、甘露醇、木糖、葡萄糖产气、H2S、蛋白胨水、棉子糖、木胶糖、乳糖、醋酸盐、鼠李糖、酒石酸盐、阿拉伯糖、KCN、丙二酸盐、粘液酸、纤维二糖、半乳糖、山梨醇、蔗糖、鸟氨酸、6%Nacl胨水、乙酰胺、DNA酶等,可以看出其生化特征不是很活泼。
16SrRNA基因序列的分析确定此细菌为交替假单胞菌(Pseudoalteromonassp.),分离细菌和假单胞菌相似度在99%以上,同源性分析显示和Pseudoalteromonas sp.E36—1和.Pseudoalteromonas sp.F925—1最为接近,可能为这两种菌株中的一种。
通过对健康刺参的回归感染和细菌的再分离鉴定,确定刺参溃疡病的病原如自然发病刺参分离的细菌一样是交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.),且发病症状相似,回归感染死亡率达100%。
病原菌药敏实验发现对交替假单胞菌敏感的抗生素有:头孢吡肟、先锋必、阿洛西林、头孢孟多、氯霉素、庆大霉素、妥布霉素、氨苄西林/舒巴坦、先锋Ⅵ、先锋噻肟、特治星、舒普深;对致病菌不敏感的抗生素有:乙酰螺旋霉素、四环素、青霉素G、林可霉素、壮观霉素、阿米卡星、复方新诺明、氟罗沙星、复达欣、苯唑青霉素、多粘菌素B、头孢呋肟、头孢噻吩、恩诺沙星、氟嗪酸、链霉素、利福平、万古霉素、萘啶酸、氨苄青霉素、头孢克肟。根据实验结果可以提出针对性的预防和治疗措施,以阻止刺参溃疡病的暴发。
大部分病变首先在刺参口部出现症状表明可能与刺参的食物或水质有关,而交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)目前只是在海底淤泥和一些海藻内发现,这表明两者之间可能存在某些联系,因为目前刺参养殖过程中一般以海带或其他海藻类的粉末和海泥作为饵料,在气温变化剧烈或养殖密度很大等原因造成刺参机体损伤或机体免疫性能较弱时,饲喂这些饵料,就有可能引起病变和此流行病的大规模暴发。