研究背景银屑病(psoriasis)是一种由免疫介导的多基因遗传性炎症性皮肤病,可由感染、外伤、药物等多种因素诱发,以皮肤角质形成细胞(keratinocyte cell,KC)发生过度增殖和异常分化为主要特征。国内患病率约为0.123%～0.47%左右,呈逐年升高趋势。该病是一种系统性疾病,具有病程较长、易反复发作、不易根治等特点,且多见于青壮年发病,严重影响患者的生活质量和身心健康。银屑病确切的病因和发病机制至今仍未完全阐明,因此,深入研究银屑病发病机制,并在此基础上寻找新的银屑病治疗靶点,成为当今世界皮肤科领域研究的热点和亟待解决的难题之一。研究证明,银屑病病理生理过程中涉及到炎症、免疫紊乱、细胞增殖与凋亡异常、细胞内信号传导通路激活等多方面因素;其中免疫失衡是发病机制的重要环节,T细胞(包括CD4+T细胞、CD8+T细胞)、固有免疫细胞(包括KC、yδT细胞、浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell,pDC)、中性粒细胞、自然杀伤性T细胞(Natural Killer T cell,NKT)、巨噬细胞)等多种细胞成分分泌一系列细胞因子、趋化因子,介导细胞内信号转导通路的活化,从而在KC、固有免疫细胞、T淋巴细胞之间相互作用,产生级联放大效应及恶性循环,最终协同作用到皮损局部KC,诱导KC发生过度增殖和异常分化,导致银屑病皮损炎症反应发生,这正是银屑病组织病理学表型的基础。临床通过控制炎症、抑制免疫反应治疗银屑病取得满意疗效。IL-22,Ⅱ型细胞因子家族成员之一。Ⅱ型细胞因子家族除了干扰素(Interferon,INF)外,又称IL-10细胞因子家族。IL-22主要由活化的Th22、Th17、Th1、NK细胞等免疫细胞分泌产生;IL-22受体是由两条链组成的异源二聚体结构,其中一条链是IL-22R1(又称为CRF2-9),另外一条链是IL-10R2(又称为CRF2-4),只有两条链同时与IL-22结合后才能具备生物学活性。在皮肤组织中,KC是IL-22作用的特异性靶细胞。IL-22可起到桥梁作用,通过KC膜表面的受体,将免疫细胞和KC二者联系起来并相互作用,介导炎症反应,参与银屑病皮损局部免疫功能紊乱。研究证明,IL-22高表达在银屑病患者皮损及血清中,与银屑病严重程度明显正相关;临床经有效抗炎症治疗,可显著降低IL-22表达水平。这证明IL-22这一炎症相关细胞因子,介导银屑病皮损免疫失衡的调节。S100A7,属于S100蛋白家族成员之一。1991年,Madsen等人最初从银屑病患者增生的KC中分离得到,因此也被称为银屑素(psoriasin)。S100A7是一种与分化相关的钙结合蛋白,通过与其配体结合,在细胞增殖分化、细胞凋亡、氧化应激、炎细胞趋化、基因表达调控等过程中发挥重要作用。研究证明,S100A7具有强趋化作用,高表达在银屑病KC中的S100A7招募中性粒细胞、单核细胞和CD4+T淋巴细胞到感染部位并分泌炎症因子介导皮损局部炎症反应发生。近年来,随着基因检测技术的发展,越来越多的非编码RNA序列被发现,尤其是对长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA)作用和调控机制的研究,已成为生命科学领域的热门课题。现已证实多个 microRNA 分子,如 miR-203、miR-99a、miR-31、miR-125b、miR-146a、miR-424等通过作用于其下游的靶基因,在调控KC增殖分化、免疫细胞炎症反应等不同层面参与银屑病发病。然而,截止目前有关lncRNA在银屑病发病中的作用尚不十分清楚,调控机制研究较少。lncRNA与miRNA都有各自的调控通路,自从竞争性内源性RNA(Competitive endogenous RNA,CeRNA)假说提出以来,lncRNA和miRNA的相互调控机制在疾病中的作用被越来越多的实验所证实。CeRNA并非是一个新发现的RNA分子,而是一种新发现的调控机制。这一机制认为lncRNA与mRNA共同具有miRNA结合位点,受到miRNA的调控,彼此之间呈正相关调控关系。lncRNA与mRNA彼此互称为ceRNA。lncRNA、miRNA、mRNA以及其他RNA之间形成一个复杂而精细的调控网络,它们相互调控的结果是ceRNA与miRNA之间处于恒稳状态。当ceRNA表达异常,ceRNA协同趋势发生表达量变化,恒稳状态失衡破坏,就会导致相关疾病发生。目前,ceRNA调控网络在银屑病发病中的作用和机制这方面罕有研究报道。因此,我们课题组首次从ceRNA角度,探究lncRNA分子在银屑病发病中可能的作用,可以帮助我们从基因层面上更深入了解银屑病的发生发展,为银屑病的靶向治疗提供新方向。研究目的本课题研究从ceRNA角度,利用lncRNA和mRNA表达谱芯片技术,高通量筛选IL-22介导的KC中差异表达的lncRNA,通过生物信息学分析和分子生物学实验,研究银屑病相关lncRNA-MSX2P1(MSX2P1)和S100A7的表达情况,分析MSX2P1对角质形成细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和相关炎症因子表达的影响,阐明MSX2P1作为一种ceRNA,通过竞争性结合miR-6731-5p对S100A7的调控机制及其在银屑病中的作用。第一部分 LncRNA差异基因筛选和验证及LncRNA-MSX2P1相关CeRNA网络图构建研究方法(1)以人永生化角质形成细胞(Human immortalized keratinocytes,HaCaT细胞)作为研究对象,实验组给予100 ng/ml IL-22刺激24h,对照组不给予100 ng/mlIL-22刺激,分别进行2次独立实验。采用RNeasy Mini Kit提取细胞总RNA,昂飞(Affymetrix)微阵列基因芯片 GeneChip Human Gene 2.0 ST Array分析差异表达的lncRNA及mRNA分子;并在另外独立样本中采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法对显著差异表达的10个lncRNA进行实验验证,以GAPDH作为内参,所得数据以2-△△Ct表示。(2)利用生物信息学方法比对芯片来源lncRNA序列,获取差异表达lncRNA序列,用于lncRNA-miRNA靶向位点的预测。结合RT-qPCR验证结果及相关文献,挑选了差异表达显著的MSX2P1作为研究对象,应用连续概率分布法(CUPID)进行ceRNA网络图构建及相应的靶基因预测。结果(1)LncRNA微阵列芯片结果表明,两组样本间差异表达的lncRNA一共有 1438 个;lncRNA表达差异倍数(Fold Change,FC)>1.5,P<0.05 的有 154个,其中上调表达的有103个(占66.9%),下调表达的有51个(占33.1%)。(2)通过对显著差异表达的10个lncRNA行RT-qPCR验证,相比于对照组,实验组中 MSX2P1、IGKV1D-27、LOC100216479、LOC100287834 和 IGLV2-23的表达均上调(P<0.05,P<0.01);LOC440895、IGKV3D-15、LOC100505942、FLJ45340和LOC284632的表达均下调(P<0.05,P<0.01);表达趋势与芯片结果一致。每组进行3个生物学重复,差异均具有统计学意义。(3)生物信息学方法鉴定IL-22介导的角质形成细胞差异表达的lncRNA相关ceRNA网络图。结合RT-qPCR验证结果,我们选择MSX2P1-miR-6731-5p-S100A7网络进行下一步功能实验和分子机制研究。第二部分LncRNA-MSX2P1和S100A7在银屑病皮损及角质形成细胞中的表达研究方法(1)对临床收集的10例寻常型银屑病皮损标本和10例健康正常皮肤组织标本进行苏木素-伊红(H&E)染色和免疫组化(IHC)染色,获得S100A7免疫组化染色典型图片。(2)采用RT-qPCR方法和蛋白质印迹法(Western Blotting)检测银屑病皮损和正常皮肤组织中MSX2P1和S100A7的表达情况,并对MSX2P1和S100A7的表达水平进行相关性分析。(3)采用 RT-qPCR 和 Western Blotting 检测 IL-22(浓度为 100 ng/ml)介导的角质形成细胞(HaCaT细胞系和人正常表皮角质形成细胞系(Human Normal EpidermalKeratinocyte,HNEK))中 MSX2P1 和 S100A7 的表达情况。对角质形成细胞进行核质分离,RT-qPCR方法检测MSX2P1在细胞核和细胞质中的表达水平。结果(1)H&E染色结果显示,临床患者皮损处留取的10例标本均符合寻常型银屑病组织病理学改变。IHC染色结果显示,银屑病患者表皮角质形成细胞中S100A7呈弥漫性高表达,显著高于正常皮肤组织。(2)RT-qPCR结果表明,在10例银屑病皮损中,MSX2P1和S100A7表达水平均高于正常皮肤组织,差异显著具有统计学意义(P<0.001)。WesternBlotting结果显示,在MSX2P1高表达的银屑病皮损中,S100A7蛋白的表达呈强阳性;在MSX2P1低表达的正常皮肤组织中,S100A7蛋白的表达呈弱阳性。S100A7的表达水平与MSX2P1呈正相关关系(R=0.635,P=0.0487)。(3)体外细胞实验RT-qPCR结果表明,浓度为100 ng/ml IL-22刺激后的角质形成细胞中MSX2P1和S100A7 mRNA表达水平较对照组明显上调;MSX2P1主要在细胞质中表达,差异显著具有统计学意义(P<0.01)。Western Blotting结果表明,100 ng/ml IL-22刺激后的角质形成细胞中S100A7蛋白表达增加。第三部分LncRNA-MSX2P1通过竞争性结合miR-6731-5p对S100A7的调控作用及机制研究方法(1)通过转染 lenti-shMSX2P1,干扰 MSX2P1 表达,RT-qPCR 和 Western Blotting检测IL-22介导的角质形成细胞中MSX2P1、miR-6731-5p和S100A7表达水平变化;通过CCK-8、流式细胞术和膜联蛋白V/PI染色检测干扰MSX2P1表达后对IL-22介导的角质形成细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响;采用ELISA法检测细胞因子IL-23、TNF-α、IL-12β表达水平变化,Western Blotting检测 IL-23、NF-κB(p65)、TNF-α、IL-12β、HLA-C 和 CCHCR1 蛋白表达水平变化。(2)转染 miR-6731-5p mimics 和 miR-6731-5p inhibitor,RT-qPCR 和Western Blotting检测IL-22介导的角质形成细胞中miR-6731-5p和S100A7表达水平变化;通过CCK-8、流式细胞术和膜联蛋白V/PI染色检测转染miR-6731-5p mimics和miR-6731-5p inhibitor后对IL-22介导的角质形成细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。(3)采用双荧光素酶报告基因实验,分别检测MSX2P1与miR-6731-5p及miR-6731-5p与S100A7的结合情况,进行靶基因验证。(4)通过 siRNA 干扰 S100A7 表达,RT-qPCR 和 Western Blotting 检测S100A7表达水平变化;通过CCK-8、流式细胞术和膜联蛋白V/PI染色检测共转染siS100A7和miR-6731-5p inhibitor后,对IL-22介导的角质形成细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响;采用ELISA法检测细胞因子IL-23、TNF-α、IL-12β表达水平变化,Western Blotting 检测 IL-23、NF-κB(p65)、TNF-α、IL-12β、HLA-C和CCHCR1蛋白表达水平变化。结果(1)通过转染lenti-shMSX2P1,干扰MSX2P1表达,发现MSX2P1的表达水平显著下调(P<0.01),说明干扰成功;同时,S100A7mRNA和S100A7蛋白表达水平也明显降低;而miR-6731-5pmRNA表达明显上调(P<0.01);CCK-8结果表明,干扰MSX2P1表达后,IL-22介导的角质形成细胞增殖活性显著降低(P<0.01);流式细胞术检测发现,干扰MSX2P1的表达诱导了 IL-22介导的角质形成细胞周期由G1期向S期转变停滞,起到抑制细胞生长的作用;膜联蛋白V/PI染色发现,干扰MSX2P1表达后,IL-22介导的角质形成细胞凋亡活性显著升高(P<0.001)。干扰MSX2P1表达后,ELISA检测细胞因子IL-23、TNF-α、IL-12β 的浓度显著降低;IL-23、NF-κB(p65)、TNF-α、IL-12β、HLA-C 和 CCHCR1的蛋白表达水平显著下降。(2)转染 miR-6731-5p inhibitor 组 RT-qPCR 结果显示,miR-6731-5p mRNA表达水平明显下调(P<0.01),说明miR-6731-5p inhibitor转染成功;同样的,miR-6731-5p inhibitor 显著上调 S100A7 mRNA 和 S100A7 蛋白表达水平(P<0.01);CCK-8结果表明,转染miR-6731-5p inhibitor组细胞增殖能力相比对照组显著升高(P<0.01);流式细胞术检测发现,转染miR-6731-5p mimics组通过使细胞周期由G1期向S期转变停滞,起到抑制细胞生长的作用;膜联蛋白V/PI染色发现,相比于阴性对照组,转染了 miR-6731-5p mimics组细胞凋亡活性显著增加,而转染miR-6731-5p inhibitor组细胞凋亡活性显著降低(P<0.001)。(3)双荧光素酶报告基因检测结果表明,上调miR-6731-5p可以抑制携带野生型(WT)MSX2P1 3’UTR载体萤火虫荧光强度(P<0.05),对携带突变型(MUT)种子序列的MSX2P1 3’UTR载体萤火虫荧光强度无显著性影响(P>0.05),证实MSX2P1与miR-6731-5p存在结合。同时,双荧光素酶报告基因实验也证实S100A7是miR-6731-5p下游直接靶基因。miR-6731-5p对S100A7起负调控作用(P<0.01)。(4)干扰S100A7表达,S100A7mRNA和S100A7蛋白表达水平显著下调(P<0.01),表明干扰S100A7成功;CCK-8结果表明,只转染siS100A7组IL-22介导的角质形成细胞增殖活性下降,共转染siS100A7和miR-6731-5p inhibitor可明显促进细胞的增殖活性(P<0.01);流式细胞术发现miR-6731-5p inhibitor抑制了 siS100A7介导的细胞周期停滞,起到促进细胞生长的作用;通过膜联蛋白V/PI染色发现,相比于只转染siS100A7组,共转染了 siS100A7和miR-6731-5p inhibitor组细胞凋亡活性显著降低(P<0.001)。ELISA检测共转染siS100A7和miR-6731-5p inhibitor组细胞上清液中IL-23、TNF-α、IL-12β的浓度显著升高;IL-23、NF-κB(p65)、TNF-α、IL-12β、HLA-C 和 CCHCR1 的蛋白表达水平也显著升高。结论(1)MSX2P1和S100A7在银屑病皮损中高表达。(2)在HaCaT和HNEK中,IL-22能够上调MSX2P1和S100A7的表达。(3)S100A7是miR-6731-5p的直接靶基因。(4)miR-6731-5p负向调控S100A7,抑制IL-22介导的角质形成细胞增殖并促进细胞凋亡作用。(5)MSX2P1作为一种内源性“miRNA海绵”直接结合miR-6731-5p,对miR-6731-5p表达起负调控作用。(6)MSX2P1通过抑制miR-6731-5p,间接激活S100A7的表达和其他炎症因子的分泌,发挥促进角质形成细胞增殖、抑制凋亡作用,促进银屑病进程。综上所述,本研究结果揭示了 MSX2P1作为竞争性内源性RNA分子,通过结合miR-6731-5p间接调控S100A7在角质形成细胞中的作用和分子机制,为更深入的了解银屑病中lncRNA介导的基因调控机制提供新视角,为银屑病的靶向治疗提供新思路。