研究背景临床实践和实验室研究表明,不同强度的压应力对骨的生理、病理活动产生不同的影响,但远未能阐明其机制。因此,深入研究压应力调控骨组织生理、病理活动的分子机制,寻找压应力促进或抑制成骨的转化条件,对临床上正确运用压应力具有重要的指导意义,并有望为探索骨伤病的疗法提供新思路。由于体内力学环境和生化环境过于复杂,难以得出可重复的结果,该领域的研究多采用体外应力环境。目前的商品化或自制的生物反应器普遍不能提供精确的仿生应力环境,也难以提供长期稳定的培养基生化环境,成为该研究领域的技术瓶颈。肝配蛋白ephrin及其受体Eph(ephrin receptor)家族近年来被发现参与了骨骼发育、重塑和骨相关疾病的调控,可能成为我们深入认识应力调控骨生理、病理活动机制的新线索。本研究采用反馈调节的设计思路,制作了一款可以为粘弹性生物材料和组织提供精确拉伸应力和压应力的新型生物反应器,以此为基础研究了体外三维仿生培养环境中间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)成骨分化的调控因素,以及Eph B4、B6参与力学-化学信号转化并调控MSC成骨分化的机制。方法1、本研究着重改进生物反应器的施力功能,在施力装置中整合柔性元件,用于施力器和组织之间的拉、压应力传递,消除刚性接触导致的应力突变、瞬态过冲。根据胫骨平台下松质骨与跟腱的受力模型编写仿生应力控制软件,为新型施力装置提供反馈控制环路。改进培养基生化环境控制系统,包括中空纤维半透膜重新选材,优化了物质交换器内部液流途径,优化pH、PO2、PCO2的控制程序。2、将组织工程骨分为静置培养、单纯应力培养和动态培养三组,以检测生物反应器的仿生应力环境和生化环境对三维培养细胞的影响。3、用PCR检测MSC成骨分化后的ephrin、Eph家族表达变化,确定EphB6为主要研究对象后,通过配体激活、siRNA、过表达研究其对MSC成骨分化的调控作用。为了解Eph B6的下游信号,检测Rho A磷酸化水平,并用ROCK抑制剂阻断rhoa-rock通路。4、在生物反应器工作参数中明确定义适度压应力、过度压应力,用免疫共沉淀、激光共聚焦研究ephb4、ephb6与整合素β亚基是否发生联系,用免疫共沉淀检测ephb与整合素β亚基是否与其他蛋白形成复合体。用生物信息学技术预测ephb与整合素β亚基是否有直接接触及可能的结合位点。结果1、在施力装置中整合柔性元件,实现对具有粘弹性的组织和生物材料均匀、稳定施力。通过有限元技术获得人体组织承受生物应力的仿生模型,并以此为依据编写了仿生应力控制软件。同时改进物质交换系统,使培养基的生化指标在预设的范围内长期保持稳定。2、改进后的生物反应器能促进组织工程骨中的msc增殖和成骨分化。在仿生压应力的作用下,三维支架里的细胞排列有序,细胞骨架伸展方向一致,表明该生物反应器能够为组织工程骨提供三维应力环境,为后继实验奠定了基础。3、定量pcr和免疫荧光染色表明ephb6在msc成骨分化时表达下调。ephb6与配体ephrinb1结合后使alp活性和runx2表达降低。sirna沉默ephb6使msc的runx2表达上调,alp活性增高,钙结节染色增强,而过表达ephb6则出现相反的结果。但上述基因操作均不会影响msc的成软骨分化和成脂肪分化。4、rhoa的磷酸化水平与成骨分化呈负相关,受到ephb6sirna干扰的细胞在成骨诱导培养第7天有更多gtp-rhoa,而过表达的细胞则显著减少。在msc成骨诱导培养基中添加rock抑制剂y-27632,发现runx2的表达上调,在sirna干扰和过表达ephb6的细胞中也同样检测到runx2的表达上调。5、本研究在自制的生物反应器上将0.5hz、峰值10%形变的仿生压应力定义为适度压应力,0.5hz、峰值20%形变的仿生压应力将过度压应力,并证实适度压应力下组织工程骨的alp活性和runx2表达增强,能促进msc成骨分化,而过度压应力则会抑制msc成骨分化。由此为后续研究确立了力学标准。6、在适度压应力下,ephb4与整合素β1形成免疫共沉淀,过度压应力下ephb6与整合素β3形成免疫共沉淀。激光共聚焦观察到,适度压应力下ephb4与整合素β1共同分布在细胞膜的部分区域,并且被募集到f-actin的起始端。而ephb6则在过度压应力下与整合素β3共同分布在细胞膜上,且募集到f-actin的起始端。7、fak、vinculin和paxilin在适度压应力和过度压应力下均与ephb4形成了免疫共沉淀,但不与ephb6发生联系。8、生物信息学分析预测EphB与整合素β亚基可能有直接联系。Eph B6可能的结合位点序列是230-290、362-393、555-580、610-635,整合素β3可能的结合位点序列是189-204、284-313。结论1、该新型生物反应器配合仿生应力控制软件和物质交换系统,能够为组织和三维生物材料提供精确仿生的应力培养环境。2、Eph B6抑制MSC成骨分化,可能是通过提高Rho A磷酸化水平来发挥作用的。沉默表达或过表达Eph B6基因操作均不会影响MSC的成软骨分化和成脂肪分化,可见EphB6是特异性地抑制MSC的成骨分化能力,而不是弱化其分化潜能。3、本研究在自制的生物反应器上定义了适度压应力和过度压应力,为后续研究确立了力学标准。发现在不同强度压应力下Eph B4、B6分别与整合素β1、β3发生联系,且EphB4、B6被募集到F-actin的起始端。由此推测,在应力环境下,整合素与F-actin(即细胞骨架)结合后,能直接接触或间接与Eph B分子形成复合体,再通过EphB向细胞内传递信号,实现力学-化学信号转化4、FAK、Vinculin和Paxilin参与了EphB4-整合素β1形成的复合体,可能具有放大信号或启动多个信号通路的作用。5、生物信息学分析预测Eph B与整合素β亚基可能有直接联系,其结合位点之一位于EphB的胞外FNⅢ重复序列。