猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是圆环病毒属的代表种,可分为PCV1和PCV2。PCV1没有致病性;PCV2引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)是猪的免疫抑制病之一,给世界养猪业造成了严重的经济损失。目前,临床上还没有有效的方法控制和消灭PCV2,市场上流通的疫苗也不能起到很好的预防效果。因此,建立一种血清学检测方法,快速、及时掌握PCV2的流行情况,做好预防措施就显得十分关键。研究利用PCV2 ORF2的原核表达蛋白作为抗原,建立间接ELISA检测方法,并初步应用于PCV2血清抗体的临床检测。首先,根据实验室保存的PCV2鄂州株(Genebank未登录)基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因,将该片段克隆至pET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,表明成功构建了阳性重组表达质粒pET-ORF2。将其转化入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析初步确定重组蛋白为34.5KDa,主要以包涵体形式表达。最佳诱导条件为:37℃条件下,摇菌至OD值0.4-0.6左右时加入终浓度1mmol/L IPTG,诱导5h时目的蛋白表达量最高,可达0.46mg/mL。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析。结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。其次,用纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立了PCV2抗体间接ELISA检测方法。其中,抗原包被浓度为4.6μg/mL,37℃孵育2h后4℃过夜;5%SMP/PBST,37℃封闭2h;待检血清的最佳稀释度为1∶40,37℃孵育1h;HRP-羊抗猪IgG稀释度为1∶3 000,37℃孵育1h;TMB显色15min。经统计学分析确定阴阳性临界值为0.421。并对优化后的间接ELISA方法的特异性、重复性进行测定并与商品化的试剂盒进行阳性符合率比较。结果显示,建立的间接ELISA方法与CSFV、PRRSV、FMDV、PRV、TGEV、PEDV的阳性血清无交叉反应,特异性好;变异系数最大为8.71%;与商品化试剂盒比较,阳性符合率达到96.7%。用建立的ELISA方法检测猪场送检血样223份,总阳性检出率为61.9%(138/223),其中保育猪阳性检出率为58.3%(63/108),育肥猪阳性检出率为65.2%(75/115)。结果表明建立的间接ELISA方法能用于临床PCV2抗体样本检测并为ELISA诊断试剂盒的开发奠定了基础。