论文部分内容阅读
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因其具有良好的自我更新与多向分化潜能，被广泛用于细胞治疗和再生医学中。现有的实验研究与临床检测发现， MSCs参与调控了骨修复过程并起到至关重要的作用，与血管生成、免疫调节及成骨分化等密切相关。骨再生过程中，MSCs能够迁移到损伤位点，增殖并开始向软骨细胞及成骨细胞分化，进一步地分别介导软骨内和膜内骨化。通常，MSCs在机体内处于一种低氧微环境中(1％-7%pO2)，甚至在骨缺损修复过程中将会承受更为严重的低氧应激。之前的研究已经表明，严重的低氧条件会显著地抑制 MSCs的细胞活力、增殖以及成骨分化，这些均是目前阶段亟需解决的问题。多种生长因子被证实在MSCs的细胞动力学、增殖以及成骨成骨分化过程中具有良好的调控作用。其中，力生长因子(mechano growth factor,MGF) E肽（下文中缩写为MGF）能够有效地保护细胞或者组织免于低氧损伤。尽管如此，MGF是否能够调控严重低氧环境条件下MSCs的增殖和成骨分化仍是未知的。本文使用氯化钴(CoCl2)模拟严重低氧环境，检测严重低氧环境下MGF预处理对MSCs的细胞增殖与成骨分化的影响。本文主要内容与相关结果如下： (1)利用CoCl2模拟低氧环境条件并进行低氧条件优化选择。 大量的实验已经证实CoCl2能够有效模拟低氧微环境，其原理是钴离子与亚铁离子能够在细胞中发生置换，并阻止低氧诱导因子?(hypoxia inducible factor1??, HIF-1??的降解，从而间接地通过促进HIF-1?积累模拟低氧。在本实验中，分别使用0、100、200、500、800和1000μM浓度的CoCl2处理MSCs细胞，24h后分别检测细胞中HIF-1?表达、细胞活力与细胞存活变化。结果表明，不同浓度的CoCl2均有效促进HIF-1?表达，并有随CoCl2浓度增加逐步上升的趋势，证明成功地建立低氧模型。24h后，MSCs细胞活力分别被0、100、200、500、800、1000μM浓度的CoCl2调节到116.85±2.23%、117.89±0.81%、69.03±1.92%、28.46±6.46%与11.55±1.99%。实验中发现，当CoCl2浓度超过500μM时，细胞开始出现明显的死亡现象。因此，本实验选择500μM浓度CoCl2作为随后实验的最优条件（对MSCs有害但非致死）。当选择500μM浓度CoCl2处理MSCs1、2、4、8、12及24h，MSCs细胞活力分别下降到92.83±2.58%、93.35±3.42%、92.55±5.35%、90.85±4.13%、91.25±5.63%以及69.23±2.20%。因此，500μM浓度CoCl2培养24h后能够显著性地抑制MSCs细胞活力但不足以诱发细胞凋亡现象，能够更适宜地模拟严重的低氧环境。 (2)严重低氧条件下MGF对MSCs增殖、凋亡、形态、粘附及迁移的影响。 本文实验结果显示，不同浓度的CoCl2(0,100,200,500,800,1000μM)处理MSCs24h后，快速地抑制了MGF mRNA表达，结果暗示了MGF参与低氧微环境对 MSCs细胞生理生化调控的可能性。通过检测MGF预处理后低氧对MSCs细胞形态、增殖、凋亡、粘附与迁移的结果显示，严重低氧条件下MSCs细胞面积收缩，圆度降低。同时，细胞贴壁实验与transwell实验结果显示，细胞粘附与迁移能力被显著地抑制，细胞动力学能力明显不足。幸运的是，MGF预处理改善了严重低氧条件下MSCs细胞活力，5、10、20、50及100ng/ml浓度的MGF分别上调了严重低氧条件下MSCs的细胞活力53.07%、55.95%、71.23%、61.09%及58.90%，且与正常组相比无明显差异。不仅如此，MGF预处理还降低了严重低氧条件下MSCs中HIF-1?的表达以及核转移，细胞圆度及细胞面积均得到不同程度的恢复，并促进了细胞粘附与迁移能力，同时对MSCs凋亡无任何影响，即不存在细胞毒性作用。 (3)MGF在严重低氧条件下对MSCs成骨分化的影响。 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性及茜素红S染色分析用以检测MGF对严重低氧条件下MSCs成骨分化的影响。参考之前的实验可知，ALP活性不仅能够作为细胞多能性的指标，同时也是干细胞早期成骨分化的重要参考，而茜素红染色能够直观地观察到细胞中钙沉积现象。分析上述实验结果显示，严重的低氧显著抑制了MSCs成骨分化，ALP活性与MSCs中钙沉积均被明显地抑制。但MGF预处理组与单独CoCl2处理组相比成骨分化能力显著恢复，ALP活性及钙沉积均得到明显提升。分别于成骨分化第0、7及14天时检测相关的标记基因ALP、runt相关转录因子2(runt related transcription factor2,Runx2)及骨钙素(bone gamma-carboxyglutamic-acid-containing proteins,BGP)的表达，结果发现在严重低氧条件下成骨分化相关的基因表达在不同时间均受到抑制，但经MGF预处理后在第7与14天时得到有效恢复。进一步地，我们检测了MGF预处理对轻度低氧100μM浓度CoCl2条件下MSCs成骨分化的影响，结果趋势与500μM浓度CoCl2条件下一致，图片结果显示更为明显。有趣的是，本文研究发现，单独的MGF处理同样促进了MSCs的成骨分化能力，与之前的研究结论并不一致。分析发现本文实验与之前研究中MGF处理细胞方式存在差异，因此，本文分别选择MGF持续处理与分化培养前一次性预处理MSCs，并检测MSCs的成骨分化现象。结果显示，MGF一次性预处理提高了MSCs的成骨分化能力，而持续性的MGF处理反而抑制了MSCs的成骨分化能力，表现出MGF处理方式的依赖性。 综上所述，本文证实严重的低氧微环境会显著性地抑制了MSCs的细胞活力，改变了细胞形态，并降低了细胞的增殖、运动及成骨分化能力，严重阻遏了骨修复进程。通过MGF的预处理后，MSCs的细胞活力得到有效恢复，细胞形态、增殖、迁移与成骨分化能力均显著性地提升。除此之外，MGF预处理有效地减弱了严重低氧对MSCs中ALP、Runx2与BGP的mRNA表达水平的抑制作用。本文阐述了MGF对严重低氧条件下MSCs细胞性能的调控作用，对于MGF应用于临床骨修复治疗提供了理论依据。