【摘 要】
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槟榔(Area Cathecu L.)为棕榈科槟榔属常绿乔木,在我国有悠久的种植历史,不仅能作为热带地区的观赏植物,而且还具有重要的药用价值。近年来,槟榔黄化型病害在海南槟榔主产区大规模发生,预估造成每年的经济损失达20亿以上,研究表明,槟榔根腐病是引起此种病害的主要病因之一。目前,对槟榔根腐病的研究尚不充分,也缺乏有效的防治措施,主要依赖农药等化学试剂处理,不利于环境的可持续发展,采用生物防治的
【基金项目】
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国家自然科学基金项目“肽适体抑制柱花草胶孢炭疽病的分子机理及应用”No.31860676); 国家农业部项目“基因智能改造与定向表达技术研究-作物根际互作促生模块”(No.2019ZX08010-004)
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槟榔(Area Cathecu L.)为棕榈科槟榔属常绿乔木,在我国有悠久的种植历史,不仅能作为热带地区的观赏植物,而且还具有重要的药用价值。近年来,槟榔黄化型病害在海南槟榔主产区大规模发生,预估造成每年的经济损失达20亿以上,研究表明,槟榔根腐病是引起此种病害的主要病因之一。目前,对槟榔根腐病的研究尚不充分,也缺乏有效的防治措施,主要依赖农药等化学试剂处理,不利于环境的可持续发展,采用生物防治的手段筛选病原菌的拮抗生防菌逐渐成为人们的研究热点。本研究从槟榔发病园区采取根腐样品,从中分离鉴定出一株新的槟榔根腐病的致病菌,然后以此病原菌为靶标,与实验室保存的60余株潜在生防菌株进平板对峙,最终筛选到一株效果良好的拮抗生防菌P42,具体研究结果如下:(1)从槟榔根腐样品中分离纯化出3株潜在的病原真菌,通过科赫法则验证潜在病原菌的致病性,最终筛选到1株新型槟榔根腐病致病真菌。对其进行形态学观察和利用ITS、SSU r DNA、LSU r DNA多基因序列进行分子鉴定,确定其为一色齿毛菌(Cerrena unicolor)。(2)以筛选到的致病真菌Cerrena unicolor做为靶标,与实验室保存的60余种潜在生防菌株进行对峙实验,共筛选到5株拮抗生防菌株,将其分别命名为P2、P6、P10、P28、P42。其中以菌株P42的抑菌效果最佳,采用16S r DNA引物序列对其进行分子鉴定,根据le BIBIQBPP在线数据库的系统进化分析将其鉴定为耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)。(3)探究优化生防菌株P42的发酵条件。分别进行LB、PDA等6种发酵培养基和24h、48h等5个发酵时长的筛选实验,最终获得生防菌株P42的最佳发酵条件为:以LB液体培养基为发酵培养基,p H为7.0,以2%的接种量转接于装液量为200m L的锥形瓶中,然后置于37℃,150rpm/min的恒温摇床培养至96h。优化后的发酵液对根腐病原菌(Cerrena unicolor)的抑菌效率为92%左右(未优化前抑菌效率为82%),比之前提高了约10%。(4)以实验室现存的10株病原真菌和5株病原细菌为靶标,测试生防菌P42的抑菌谱,结果表明生防菌P42对病原真菌槟榔根腐病菌(Cerrena unicolor)、芒果蒂腐病菌(Botryodiplodia theobromae Pat.)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、火龙果软腐病菌(Gilbertella persicaria)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、火龙果溃疡病菌(Neoscytalidium dimidiatum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)均有良好抑制效果,最低抑菌效率在40%以上,对芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioiles)、冬瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare Arx.)等无明显抑制效果;对病原细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)有良好抑制效果,对大肠杆菌(Escherichia coli BL21)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)无明显抑制效果。(5)探究生防菌P42的抑菌机理,结果表明:生防菌P42的无菌发酵滤液可抑制槟榔根腐病菌(Cerrena unicolor)孢子的萌发,使其在PDA培养基平板上无法生长;同时可破坏病原孢子的质膜,造成孢子死亡,从而达到抑菌目的。(6)对生防菌P42的无菌发酵滤液的理化性质进行了初步研究,发现拮抗菌的无菌发酵滤液分别经紫外线、温度、酶、酸碱处理和在4℃下储存45天后仍保持较高抑菌活性,表明生防菌P42的无菌发酵滤液具有较高的耐受性和稳定性。(7)对生防菌P42的代谢产物进行提取分离,采用乙酸乙酯萃取、硫酸铵沉淀、盐酸沉淀甲醇抽提3种方法来提取拮抗菌P42无菌发酵滤液中的抑菌活性物质,经抑菌验证,三种方法的提取产物均对槟榔根腐病菌有较强的抑制作用。(8)对生防菌P42进行了全基因组测序,基于测序结果,对菌株P42的COG功能分类、KEGG代谢通路、GO功能分类等进行了研究分析,结果表明,大量的功能基因和丰富的代谢途径,为菌株P42的生长繁殖和次级代谢产物的生物合成提供了充足的碳氮源,使菌株可以产生丰富的抗菌活性物质;通过对菌株的抗菌活性物质基因簇的预测分析证实了菌株可以产生目前已有研究报道过的3种抗菌活性物质(细菌素类、萜类、套索肽)和2种比较新型的抗菌活性物质(β-内酯类和聚酮类化合物)。
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