猪圆环病毒2型（PCV2）是断奶后仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的病原,其可造成严重的免疫抑制,进而继发感染其他病原,这种混合感染的情况对养猪业造成巨大的经济损失。目前,疫苗接种仍然是预防PCV2感染最有效的方式。PCV2主要有8个亚型（PCV2a-h）,随着免疫压力增加,近几年我国PCV2主要流行基因型由PCV2b向PCV2d转换。然而,商品化疫苗株主要是基于PCV2a或PCV2b亚型的灭活苗和亚单位疫苗,其对PCV2d型的交叉保护作用尚不明确。Cap蛋白作为PCV2主要免疫原性蛋白,是研制PCV2基因工程疫苗的靶点。本研究围绕PCV2d亚型的Cap VLPs组装、免疫原性评价、Cap VLP递送外源蛋白能力和Cap表位鉴定等方面进行了探索,为PCV2d Cap蛋白的VLPs亚单位疫苗研发提供新的方法和思路。本研究主要研究内容如下:1.PCV2d Cap蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达基于PCV2d亚型毒株HLJ1501（GenBank:KY940534.1）,按照原核密码子偏好性进行序列优化后,合成缺失Cap蛋白N端16个氨基酸的编码序列。重组表达质粒pET28a-2dCap-16转化至Rosetta表达菌株,并对表达条件（IPTG、温度、诱导时间）进行优化。SDS-PAGE和Western blot结果显示,重组蛋白大部分为可溶性表达并且能与PCV2多克隆抗体反应,具备良好的抗原性,可为PCV2的诊断和VLPs疫苗制备提供试验材料。2.PCV2d Cap蛋白VLPs疫苗的制备及免疫原性初步鉴定利用超滤透析系统将纯化的Cap蛋白的咪唑溶液,替换为Cap VLP组装缓冲液。VLP组装完成后,透射电镜下可见大量形状规整的、直径约17nm的病毒样颗粒。将组装的Cap VLPs与单体形式的Cap蛋白分别免疫小鼠,同时设置商品化疫苗和PBS对照组。血清ELISA检测结果显示,相同剂量的Cap VLPs能够诱导比单体形式的Cap更高的PC V2特异性抗体,低剂量VLPs疫苗能诱导和商品化疫苗相当的抗体水平。这些结果表明,本研究制备的Cap VLPs相对于单体的Cap蛋白,具有更好的免疫原性,可作为用于PCV2d防控的候选亚单位疫苗。3.C端融合外源蛋白对PCV2d Cap VLPs组装的影响为了探究Cap VLPs递送外源蛋白的能力,本实验以构建好的pET28a-2dCap-d16为模板,在Cap基因C端插入两个猪瘟病毒囊膜蛋白E2中和表位ep（TAVSPTTLR）,获得重组质粒 pET28a-2dCap-d16-2ep,转化至 Rosetta 菌株进行蛋白表达。SDS-PAGE和Western blot结果显示,Cap-2ep VLPs不仅能和PCV2多克隆抗体结合,也能和E2单克隆抗体反应。透射电镜结果显示,Cap-2ep融合蛋白可以形成大小均一的病毒样颗粒,且与野生型VLPs形态和大小类似。Cap-2ep VLPs免疫小鼠后,血清ELISA结果显示,Cap-2ep VLPs能够产生与野生型VLPs同等的抗体水平,均能诱导小鼠产生高水平的特异性免疫应答。因此,C端插入外源蛋白未影响Cap自组装形成VLPs的能力,完整保留Cap的免疫原性。这些结果为基于PCV2d VLPs的二价苗研发提供了新的思路。4.PCV2d Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定为了进一步了解PCV2d亚型Cap蛋白的抗原表位,本研究将获得的PCV2d Cap蛋白免疫BALB/c小鼠,结合传统的杂交瘤技术和ELISA筛选,获得了 6株杂交瘤细胞株4D4、4H8、5E3、5H7、6F3和3E3。IFA结果表明,6株单抗均能与PCV2b毒株发生特异性反应,可用于鉴定PCV2毒株。通过与Cap蛋白不同截短蛋白的反应性分析,6株单抗均识别抗原表位207YDQDYN212,此表位为PCV2 Cap蛋白未发现的线性表位。结合Cap蛋白氨基酸序列比对分析,表位中D210E突变不影响单抗对PCV2b型的识别,进一步表明此类单抗适用于PCV2的检测和诊断。