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口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种感染偶蹄类动物的急性、烈性、传染性病毒疾病,感染包括牛,猪,羊家畜和其它许多野生动物物种。如果一个正常无口蹄疫的国家暴发和流行口蹄疫,感染动物的生产力将严重下降,甚至被扑杀,同时由于疫区封锁和动物产品贸易的限制,将会个该国家带来巨大的经济损失和负面的政治影响。目前防止口蹄疫传播的控制措施主要包括限制动物的活动,屠宰患病动物和与患病动物密切接触病的动物,以及在一些流行地区定期对动物进行大规模疫苗接种。对发达国家来说,上述三个措施基本都可以做到,但对那些经济实力差、技术落后的发展中国家,完全扑杀感染动物和密切接触动物是不现实的,疫苗免疫仍然是这些国家控制和预防口蹄疫发生的主要手段。我国根据实际国情,目前实行积极预防,国家强制免疫为主,一旦发现口蹄疫,立即采取扑杀相结合的综合防控策略。灭活疫苗是当前我国和世界上使用最广泛的疫苗,在控制和净化口蹄疫方面发挥了重大作用。但是,灭活疫苗在实际生产和使用过程中有很多限制性因素。例如,在培养口蹄疫病毒时,病毒逃逸生产现场和灭活不彻底等安全风险;疫苗可能含痕量的口蹄疫病毒非结构蛋白,造成无法区别动物免疫和病毒感染;灭活疫苗热稳定性差,在运输和贮藏整个过程需要低温;灭活疫苗可以预防口蹄疫发生,但是一旦爆发,不能从感染动物中清除体内存在的病毒。为解决灭活疫苗的这些缺点,目前许多努力致力于开发新型疫苗,安全高效的表位疫苗就成了候选疫苗之一。本研究选择O型口蹄疫结构蛋白VP1上两个B细胞表位和一个T细胞表位以及非结构蛋白3A上的一个T细胞表位作为靶序列表位,在其中一个B细胞表位中引入一个氨基酸突变,然后将4个表位进行不同顺序排列组合和表位的串联重复。通过人工合成3条核苷酸序列,构建重组质粒,在大肠杆菌中表达目的蛋白,重组蛋白经过纯化、复性和环化,免疫动物。其中重组多表位蛋白r P2在豚鼠体内刺激产生了略高于商业合成肽疫苗的特异性抗体水平,在体外,并诱导了强的细胞免疫反应。重组多表位蛋白r P2和佐剂ISA 50V2乳化后免疫猪,也刺激猪产生了和商品化疫苗无差异的抗体水平。在宿主动物猪上做攻毒保护试验时,重组蛋白r P2免疫猪中仅有部分猪(2/5)抵抗了FMDV的攻击。同时,以噬菌体MS2作为展示外源多肽的病毒样颗粒平台,构建并表达了嵌合FMDV表位的重组蛋白,该嵌合蛋白可以在体外自组装成病毒样颗粒,纯化后免疫动物,嵌合VLPs诱导动物产生了高于合成肽疫苗的特异性抗体滴度,也刺激产生了高于串联重复蛋白的细胞免疫反应。1、猪O型口蹄疫重组串联多表位抗原制备及免疫原性分析根据国内流行的猪O型口蹄疫SEA拓扑型Mya98谱系O/MYA98/BY/2010毒株序列,选择FMDV VP1上第124-167位(包含G-H环及其两翼序列),第200-213位作为B细胞表位,VP1上第21-40位和非结构蛋白3A上第21-35位作为T细胞表位,在第124-167位上第158氨基酸引入突变(P158C)。将4个表位序列不同组合和串联重复,密码子优化后,人工合成3条序列。构建重组原核表达载体,转入大肠杆菌中诱导表达,三个蛋白均以包涵体形式表达。三个蛋白经过纯化,复性和环化,Western和间接ELISA检测,得到了有免疫活性的重组蛋白。三个重组蛋白和商业合成肽疫苗免疫豚鼠,经过环化和两个串联重复的多表位蛋白r P2刺激豚鼠产生了和合成肽疫苗无显著性差异的特异性抗体,并诱导产生了高于重组蛋白r P1和r P3的淋巴细胞增殖和细胞因子浓度(IL-2和IFN-γ)。从4种不同种类的佐剂中,选择佐剂ISA 50V2和重组多表位蛋白r P2组合是最优配伍。佐剂ISA 50V2和r P2乳化后免疫猪,刺激产生了和合成肽疫苗相当的特异性抗体水平。在攻毒保护试验中,免疫后第28天1000 ID50/2m L的O/Mya98/BY/2010开始攻毒,观察10天,5头猪中仅有2头猪抵抗了病毒的攻击,3头猪发病,其中2头猪延缓了发病时间,分别在第8天和第10天在一条腿蹄趾处出现水泡。重组多表位蛋白虽产生了部分保护,但还没有达到预期目的,需进一步分析原因,以待解决。2、噬菌体MS2介导的展示猪O型口蹄疫G-H Loop病毒样颗粒构建及免疫原性分析本试验以噬菌体MS2作为展示外源表位的载体平台,通过RT-PCR和SOE-PCR将FMDV VP1上第131-160位氨基酸基因序列插入噬菌体MS2外壳蛋白A-B环第15-16位氨基酸中间。构建重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,嵌合蛋白经过PEG8000的初步纯化和凝胶过滤的进一步纯化,得到纯度达90%的目的蛋白,经过DLS和TEM物理表征,证实30个氨基酸的插入没有影响MS2外壳蛋白的组装,嵌合蛋白在体外自组装形成了嵌合病毒样颗粒。DOT-ELISA进一步表明口蹄疫表位被很好的展示在MS2病毒样颗粒表面。嵌合病毒样颗粒r P-CP-EP131-160和串联多表位蛋白r P–(EP131-160)3免疫小鼠,和串联多表位蛋白相比,嵌合病毒样颗粒诱导产生了更高的特异性抗体水平和更强的T细胞反应。在豚鼠免疫试验中,得到了类似的结果。在宿主猪体内是否也可以产生和合成肽疫苗同样的抗体水平,以及能否在猪免疫攻毒保护试验中提供完全保护,最终保护效果需要进一步动物试验来确认。