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核酸编码技术,是指人为对核酸序列(包含核苷酸单体)的序列排布、修饰的方式和种类等进行设计,使核酸序列具有携带额外信息的能力。高通量测序技术作为一种快速而有效的序列测定技术,自2005年问世以来在生命科学研究中扮演着越来越重要的角色。然而,较低的样本并行分析能力制约了高通量测序技术在以miRNA样本为代表的较低复杂度样本中的应用,同时,较长的测序运行时间也影响该技术得到更广泛应用。核酸编码技术,通过对高通量测序技术使用的核酸序列和核苷酸单体进行设计和改造,为高通量测序技术性能的提升提供了一条新的思路。本论文以高通量测序技术中的核酸序列和核苷酸单体为研究对象,旨在提升高通量测序的技术指标,特别是样本并行分析能力和测序运行时间,拓宽高通量测序技术的应用范围。
1.用于SOLiD测序平台的miRNA文库制备方法研究现有的基于SOLiD高通量测序平台的miRNA文库制备方案,由于使用一对双链接头,在文库制备的同一步骤加入反应体系,会在测序文库中产生较高数量的接头自连接序列。本论文对该方案进行了改进,采用一对单链RNA接头,分别只具有5末端和3具有连接活性。接头分两轮连接到miRNA样本的两侧,每轮连接反应仅使用一条接头,每步连接之后应用凝胶电泳对文库进行长度选择和纯化。研究结果表明,改进后的方案减少了71％的接头自连接序列,为利用SOLiD测序平台研究miRNA提供了更加高效的研究方法。
2.双标签编码的高通量测序miRNA文库制备方法研究在一张测序芯片上,高通量测序技术已经能够并行分析超过10亿个DNA片段。这使得高通量测序技术应用于诸如miRNA这类较低复杂度的样本(较低测序通量需求)时显得不够高效和经济。针对这一问题,发展了双核酸标签编码的样本制备技术,该技术在测序样本的两侧各设计了一条核酸标签,利用这对核酸标签编码确定样本信息。使用12种标签完成了对32个miRNA样本的并行分析。研究结果表明,双标签编码方案能够制备可靠的miRNA文库,特别适用于大量样本的并行分析。
3.双标签编码miRNA测序方法的生物信息学研究双标签编码的miRNA测序方法面临如何选择合适的核酸编码标签,如何快速高效地从测序数据中挖掘有用信息等生物信息学挑战。针对这些挑战,设计了一组长为6位的核酸标签序列,开发了一套适用于双标签编码的数据处理流程,重点研究了解码流程和miRNA归一化方法。研究结果表明,所提供的115种核酸标签序列能够准确分辨标签种类;所设计的解码流程可实现对双标签编码方案测序结果的精确解码;经比较,分位数-分位数法具有更好的归一化效果。
4.基于双标签编码的乳腺癌相关样本miRNA表达研究乳腺癌是全世界妇女最常见的癌症,为了研究miRNA在乳腺癌样本的表达情况,基于高通量测序的双标签编码miRNA文库制备方案和数据处理流程,研究了乳腺癌相关样本的miRNA表达情况。在对miRNA进行筛选后,共发现22种miRNA在26个乳腺癌样本和6个乳腺良性组织样本间存在表达水平差异。这一筛选为后续研究乳腺癌与miRNA的相关性奠定了一定的基础。
5.信号组合编码的测序探针技术研究现有的使用荧光基团标记测序探针(包含核苷酸单体)的测序平台中,大多采用最基本荧光基团与测序探针一对一和一对多的编码方式,只能在一轮反应中测定一位碱基的序列信息。设计了信号组合编码的测序探针方案,对多种标记物进行组合后,采用每种组合方式标记一种或一类核酸序列(包括核苷酸单体)。在迷你测序证明了方案的可行性,并表明信号组合编码方案能够应用于高通量测序平台。该方法是目前国际上唯一可以在一轮测序反应测定2位碱基的方案。