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毛竹（Phyllostrachvs edulis）是竹类植物中分布面积最大，用处最广，集经济、生态、社会效益于一体的笋材两用竹种。毛竹是单稔植物，一生只开一次花，具有开花周期长，花期不确定的特点，开花后大面积死亡，造成严重的经济损失和生态环境的破坏。目前为止，毛竹开花调控的分子机制尚不清楚，干旱和光周期协同作用对毛竹开花机理的研究尚未报道，因此开展毛竹开花启动调控机理的研究，不仅具有重要的科学价值，还具有很高的生物学意义。
本研究以毛竹基因组数据库为基础，以生物信息学为切入点，从全基因组层面对毛竹Dof转录因子家族进行鉴定和表达模式分析，筛选出毛竹非生物胁迫和开花启动关键的Dofs基因，进行功能验证，鉴定并分离PheDofs下游调控因子和互作蛋白，初步探索干旱和光周期调控毛竹开花的分子机制，主要结果如下:
1.毛竹PheDof转录因子家族鉴定和表达模式分析
通过2018版毛竹基因组数据，对Dof转录因子家族进行了全面的鉴定和分析，共鉴定到65条PheDofs转录因子，与2013版毛竹基因组相比，鉴定出39条新的PheDofs转录因子。65个PheDofs分为4个亚家族，均含有保守的zf-dof结构域;进一步对基因结构、蛋白质基序和分离时间进行了全面分析。组织特异性检测结果显示，大部分PheDofs在毛竹开花叶片、花芽和花发育的早期阶段表达量较高，具有组织特异性。光周期处理条件下，PheDofs基因呈现显著的昼夜振荡表达模式，大部分PheDofs在光照起始阶段表达丰度达到峰值，黄昏时转录水平降为最低。干旱和低温诱导大部分PheDofs基因上调表达，200mM NaCl处理后下调表达。表明PheDofs参与毛竹生长发育和非生物胁迫响应，具有功能多样性。
2.毛竹PheDof转录因子的分离及功能初步研究
利用分子生物学方法，从毛竹中分离得到6个含有保守结构域的PheDofs基因(PheDof1、PheDof2、PheDof4-1、PheDof12-1、PheDof12-2、PheDof26），结构分析表明，PheDof1含有一个外显子，其余5个基因均含有两个外显子，一个内含子。亚细胞定位显示，6个PheDofs基因均定位在细胞核中，具有转录活性;PheDofs参与ABA和GA3胁迫响应。
3.转毛竹PheDofs基因拟南芥的非生物胁迫功能研究
GUS染色结果显示，PheDof4-1在转基因拟南芥的根部和下胚轴中表达，PheDof12-1在转基因植株的根部、下胚轴、叶片维管束、雄蕊和花瓣中表达。干旱胁迫条件下，与野生型相比，超表达PheDof12-1转基因拟南芥种子萌发时间早、生长速度快、根系较长，提高转基因拟南芥干旱胁迫耐受性:在150mM NaCl培养条件下，超表达PheDof26和RNAi干扰后转基因拟南芥盐胁迫耐受性增强，反义表达PheDof26降低转基因植株盐胁迫耐受性。超表达PheDof4-1导致转基因拟南芥在干旱和盐胁迫条件下萌发率低，生长缓慢，幼苗黄化，胁迫相关基因CBF2、CBF3、COR15A、KIN1、RD22、DREB2A、ERD1O、ZAT12下调表达，降低转基因拟南芥干旱胁迫耐受性:反义表达PheDof4-l诱导胁迫相关基因上调表达，提高转基因植株干旱胁迫耐受性。通过酵母双杂交文库，初步筛选到抗性相关蛋白PheeIF5A可以与PheDof4-1发生蛋白互作。
4.转毛竹PheDofs基因拟南芥的开花启动功能研究
qRT-PCR检测结果显示，PheDof12-1在毛竹花发育的花芽形成期，未开花叶片和苞片中高量表达:超表达PheDof12-1导致转基因植株开花提前，开花诱导因子FT、SOC1、AGL24上调表达，开花抑制因子FLC、FVP下调表达，表明PheDof12-1是开花促进因子。超表达PheDof4-1和PheDof26延长转基因拟南芥开花时间，起负调控作用;PheDof26RNAi干扰植株开花时间明显提前，开花诱导基因上调表达。PheDop6不仅参与转基因拟南芥开花调控，而且影响转基因植株叶片衰老，与野生型拟南芥相比，RNAi干扰植株叶片黄化，莲座叶干枯，提前衰老，超表达PheDof26转基因植株叶片翠绿，延迟衰老。通过酵母单杂交实验，初步鉴定PheDofs转录因子间的调控关系，PheDof1可以与PheDof12-2启动子结合;PheDof1、PheDof12-2、PheDof26可以与PheDof4-1的启动子结合:PheDof1与PheDof26发生蛋白互作。PheDofs可以调控下游基因PheCOL4、PheCOL3和PheFD的转录，推测PheDofs可能通过调节PheCOLs及PheFD基因的表达调控毛竹开花。
5.PheDofs调控毛竹开花通路初步鉴定
AtCDFs与CO和FT启动子结合，是转录抑制因子。酵母单杂交结果显示，PheDofs可以与PheCOLs和PheFD启动子结合，推测Dof对CO和FT的调控作用在毛竹是保守的，因此对PheCOLs基因家族进行鉴定和挖掘。筛选出14条PheCOLs基因，大部分PheCOLs在毛竹叶片中表达量较高，具有显著的昼夜振荡表达模式，参与光周期响应。本研究从毛竹中分离得到拟南芥CO和FT同源基因PheCOL14和PheFT，PheCOL14定位细胞膜上，不具有转录活性，PheFT双定位于细胞核和细胞膜，具有转录活性。酵母单杂交结果显示，PheCOL14和PheFT分别与PheCOL3和PheFD启动子结合。酵母双杂交实验表明，PheDof12-1和PheDof4-1分别与PheCOL14和PheFT发生蛋白互作，推测PheDofs可能通过调节PheCOLs和PheFD基因的表达调控毛竹开花，本研究初步揭示Dof、CO和FT相互作用调控毛竹开花的可能网络途径。
综上所述，本文以毛竹为研究对象，利用生物信息学和分子生物学方法，研究了毛竹Dof转录因子调控非生物胁迫响应和开花启动的功能。研究发现:6个关键PheDofs基因在非生物胁迫和光周期开花调控过程中发挥重要作用;PheDof12-1提高转基因拟南芥干旱胁迫耐受性，同时诱导转基因拟南芥提前开花，起正调控作用;PheDof4-1和PheDof26延长拟南芥的开花时间，起负调控作用;PheDof4-1可以与抗性相关蛋白PheeIF5A和开花诱导因子PheFT互作，Dof转录因子之间可以相互调控，同时调控CO和FD的转录。本研究结果为毛竹抗性育种和开花分子调控机理研究提供科学依据。
本研究以毛竹基因组数据库为基础，以生物信息学为切入点，从全基因组层面对毛竹Dof转录因子家族进行鉴定和表达模式分析，筛选出毛竹非生物胁迫和开花启动关键的Dofs基因，进行功能验证，鉴定并分离PheDofs下游调控因子和互作蛋白，初步探索干旱和光周期调控毛竹开花的分子机制，主要结果如下:
1.毛竹PheDof转录因子家族鉴定和表达模式分析
通过2018版毛竹基因组数据，对Dof转录因子家族进行了全面的鉴定和分析，共鉴定到65条PheDofs转录因子，与2013版毛竹基因组相比，鉴定出39条新的PheDofs转录因子。65个PheDofs分为4个亚家族，均含有保守的zf-dof结构域;进一步对基因结构、蛋白质基序和分离时间进行了全面分析。组织特异性检测结果显示，大部分PheDofs在毛竹开花叶片、花芽和花发育的早期阶段表达量较高，具有组织特异性。光周期处理条件下，PheDofs基因呈现显著的昼夜振荡表达模式，大部分PheDofs在光照起始阶段表达丰度达到峰值，黄昏时转录水平降为最低。干旱和低温诱导大部分PheDofs基因上调表达，200mM NaCl处理后下调表达。表明PheDofs参与毛竹生长发育和非生物胁迫响应，具有功能多样性。
2.毛竹PheDof转录因子的分离及功能初步研究
利用分子生物学方法，从毛竹中分离得到6个含有保守结构域的PheDofs基因(PheDof1、PheDof2、PheDof4-1、PheDof12-1、PheDof12-2、PheDof26），结构分析表明，PheDof1含有一个外显子，其余5个基因均含有两个外显子，一个内含子。亚细胞定位显示，6个PheDofs基因均定位在细胞核中，具有转录活性;PheDofs参与ABA和GA3胁迫响应。
3.转毛竹PheDofs基因拟南芥的非生物胁迫功能研究
GUS染色结果显示，PheDof4-1在转基因拟南芥的根部和下胚轴中表达，PheDof12-1在转基因植株的根部、下胚轴、叶片维管束、雄蕊和花瓣中表达。干旱胁迫条件下，与野生型相比，超表达PheDof12-1转基因拟南芥种子萌发时间早、生长速度快、根系较长，提高转基因拟南芥干旱胁迫耐受性:在150mM NaCl培养条件下，超表达PheDof26和RNAi干扰后转基因拟南芥盐胁迫耐受性增强，反义表达PheDof26降低转基因植株盐胁迫耐受性。超表达PheDof4-1导致转基因拟南芥在干旱和盐胁迫条件下萌发率低，生长缓慢，幼苗黄化，胁迫相关基因CBF2、CBF3、COR15A、KIN1、RD22、DREB2A、ERD1O、ZAT12下调表达，降低转基因拟南芥干旱胁迫耐受性:反义表达PheDof4-l诱导胁迫相关基因上调表达，提高转基因植株干旱胁迫耐受性。通过酵母双杂交文库，初步筛选到抗性相关蛋白PheeIF5A可以与PheDof4-1发生蛋白互作。
4.转毛竹PheDofs基因拟南芥的开花启动功能研究
qRT-PCR检测结果显示，PheDof12-1在毛竹花发育的花芽形成期，未开花叶片和苞片中高量表达:超表达PheDof12-1导致转基因植株开花提前，开花诱导因子FT、SOC1、AGL24上调表达，开花抑制因子FLC、FVP下调表达，表明PheDof12-1是开花促进因子。超表达PheDof4-1和PheDof26延长转基因拟南芥开花时间，起负调控作用;PheDof26RNAi干扰植株开花时间明显提前，开花诱导基因上调表达。PheDop6不仅参与转基因拟南芥开花调控，而且影响转基因植株叶片衰老，与野生型拟南芥相比，RNAi干扰植株叶片黄化，莲座叶干枯，提前衰老，超表达PheDof26转基因植株叶片翠绿，延迟衰老。通过酵母单杂交实验，初步鉴定PheDofs转录因子间的调控关系，PheDof1可以与PheDof12-2启动子结合;PheDof1、PheDof12-2、PheDof26可以与PheDof4-1的启动子结合:PheDof1与PheDof26发生蛋白互作。PheDofs可以调控下游基因PheCOL4、PheCOL3和PheFD的转录，推测PheDofs可能通过调节PheCOLs及PheFD基因的表达调控毛竹开花。
5.PheDofs调控毛竹开花通路初步鉴定
AtCDFs与CO和FT启动子结合，是转录抑制因子。酵母单杂交结果显示，PheDofs可以与PheCOLs和PheFD启动子结合，推测Dof对CO和FT的调控作用在毛竹是保守的，因此对PheCOLs基因家族进行鉴定和挖掘。筛选出14条PheCOLs基因，大部分PheCOLs在毛竹叶片中表达量较高，具有显著的昼夜振荡表达模式，参与光周期响应。本研究从毛竹中分离得到拟南芥CO和FT同源基因PheCOL14和PheFT，PheCOL14定位细胞膜上，不具有转录活性，PheFT双定位于细胞核和细胞膜，具有转录活性。酵母单杂交结果显示，PheCOL14和PheFT分别与PheCOL3和PheFD启动子结合。酵母双杂交实验表明，PheDof12-1和PheDof4-1分别与PheCOL14和PheFT发生蛋白互作，推测PheDofs可能通过调节PheCOLs和PheFD基因的表达调控毛竹开花，本研究初步揭示Dof、CO和FT相互作用调控毛竹开花的可能网络途径。
综上所述，本文以毛竹为研究对象，利用生物信息学和分子生物学方法，研究了毛竹Dof转录因子调控非生物胁迫响应和开花启动的功能。研究发现:6个关键PheDofs基因在非生物胁迫和光周期开花调控过程中发挥重要作用;PheDof12-1提高转基因拟南芥干旱胁迫耐受性，同时诱导转基因拟南芥提前开花，起正调控作用;PheDof4-1和PheDof26延长拟南芥的开花时间，起负调控作用;PheDof4-1可以与抗性相关蛋白PheeIF5A和开花诱导因子PheFT互作，Dof转录因子之间可以相互调控，同时调控CO和FD的转录。本研究结果为毛竹抗性育种和开花分子调控机理研究提供科学依据。