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目的:应用RNAi(RNA干扰)技术沉默STAT3(信号转导子和转录激活子3),筛选出能稳定表达siRNA-STAT3基因的细胞系,观察对Hep-2细胞增殖力及侵袭力的影响,在蛋白水平上进一步探讨STAT3作用于Hep-2细胞增殖和侵袭可能的机制。以寻找抑制喉癌增殖和侵袭的新方法,为临床通过基因沉默技术治疗喉癌提供实验支持和理论依据。方法:构建重组质粒真核表达载体PGPU6/GFP/Neo-siRNA-STAT3,将重组表达质粒用脂质体LipofactaminTM2000转染人喉癌Hep-2细胞,通过G418持续单克隆筛选,Western-blot印迹法鉴定,进而筛选出稳定表达siRNA-STAT3的细胞系。实验分为三组:siRNA-STAT3组、siRNA-shNC组及空白对照组。应用流式细胞术检测Cyclin Dl、P21、ICAM-1、VEGF蛋白水平的表达情况及细胞周期的变化;采用MTT法观察接种培养板1d、2d、3d、4d、5d、6d后喉癌Hep-2细胞增殖状态;MTT法观察其粘附性的变化;细胞划痕法观察其迁移性;Transwell法检测其侵袭能力的变化。结果:(1)构建了重组pGPU6/GFP/Neo-siRNA-STAT3质粒载体通过模板退火和载体的线性化等步骤,构建了重组质粒表达载体。酶切结果表明,所有质粒均为阳性重组载体。(2)细胞转染与G418筛选荧光显微镜下观察瞬时转染6小时后较多Hep-2细胞内有绿色荧光蛋白(GFP)表达,24小时后GFP表达明显增强。G418筛选结果显示空白对照组的细胞全部死亡,而siRNA-STAT3转染组和siRNA-shNC转染组的细胞出现明显而且数量较多的细胞克隆集落形成。(3)Western-blot鉴定p-STAT3的表达结果显示siRNA-STAT3组的p-STAT3的表达明显减少,而siRNA-shNC组和空白对照组细胞p-STAT3的表达未见有下降。(4)MTT检测细胞增殖状态Hep-2细胞在稳定转染siRNA-STAT3后,同空白对照组和转染siRNA-shNC无关质粒组比,2天后就开始表现出较明显的抑制效应(P<0.05),即使6天后在对照组细胞生长变缓时,siRNA-STAT3组Hep-2细胞生长抑制仍较明显(P<0.05),故其抑制效应随时间延长愈明显,并表现出一定的时间抑制效应关系。(5)平板克隆形成试验2周后,观察三组均有一定的单克隆集落形成。结果显示siRNA- STAT3组Hep-2细胞克隆形成率为(15.17±2.32)%明显低于siRNA-shNC组(24.33±1.97)%及空白对照组(26.33±2.16)%(P<0.05)。(6)流式细胞术(FCM)检测细胞周期应用FCM检测细胞周期分布,转染重组siRNA-STAT3质粒的Hep-2细胞G1期比率由(60.7±0.9)%上升至(66.0±2.0)%(P<0.05),S期所占比率由(34.8±1.1)%降至(24.6±1.9)%(P<0.05)。(7)FCM检测Cyclin Dl、P21、ICAM-1、VEGF蛋白的表达观察siRNA-STAT3组Cyclin Dl、ICAM-1、VEGF蛋白表达荧光指数分别为0.71±0.08(P<0.05)、0.83±0.06(P<0.05)、0.74±0.02(P<0.05),均低于siRNA-shNC组,siRNA-STAT3组P21蛋白表达荧光指数(1.39±0.10)则高于siRNA-shNC组(P<0.05)。(8)细胞黏附试验应用MTT法检测细胞在Matrigel基质上的粘附性,接种96孔培养板20分钟后观察各组细胞的黏附率相差不大(P>0.05),但有一定的趋势性,40分钟后siRNA-STAT3组的黏附率小于siRNA-shNC组和空白对照组(P<0.05),这种抑制效应在60分钟后更加明显(P<0.05)。(9)细胞迁移试验在培养板生长48小时后,荧光显微镜下见空白对照组和siRNA-shNC组的Hep-2细胞向划痕区生长速度明显快于siRNA-STAT3组,而空白对照组和siRNA-shNC组的Hep-2细胞向划痕区生长速度差异不明显。(10)体外侵袭试验各组细胞接种Transwell小室上室内24小时后,400×光学显微镜下随机5个视野中观察siRNA-STAT3组穿过Matrigel基质和滤膜的细胞(85.20±4.92)明显少于空白对照组(122.8±7.50)和siRNA-shNC组(126.4±8.73)(P<0.05)。结论:1、成功构建了重组pGPU6/GFP/Neo-siRNA-STAT3质粒载体。2、应用G418筛选出稳定表达siRNA-STAT3基因的喉癌Hep-2细胞系。3、抑制STAT3的活性后Hep-2细胞周期形成G1期阻滞,其增殖能力和单克隆形成能力均明显下降。说明喉癌细胞具有无限增殖能力与STAT3的高表达有一定的关联。4、本实验应用RNA干扰技术沉默STAT3活性发现能抑制喉癌Hep-2细胞的粘附、迁移及侵袭能力。推测表达STAT3基因的喉癌细胞因提高了其黏附、迁移和降解基质的能力而增加了侵袭到达周围的组织及远处转移并定植生长的机会。说明STAT3在喉癌的侵袭及转移中起着重要的作用。5、阻断STAT3信号通路后,STAT3下游调控蛋白CyclinD1、VEGF、ICAM-1的表达降低,而P21蛋白的表达升高。提示CyclinD1、P21、VEGF、ICAM-1蛋白可能在STAT3的诱导下参与了STAT3信号通路对喉鳞癌细胞增殖、侵袭及浸润转移的作用。