RNA干扰目前已经成为哺乳动物细胞中研究特定基因功能的主流分子生物学手段。大规模的基于RNA干扰的分析方法受到脱靶效应以及干扰素响应等现象的影响，产生假阳性结果，这主要是由使用高浓度的siRNA所导致。但在RNA干扰实验中，降低siRNA的浓度会伴随着基因沉默效率的降低。所以如何寻求适当的siRNA的使用量并得到真实的干扰效果，成为了使用RNA干扰技术的重要问题。本文正是着眼于RNA干扰机制中这样的现状，提出影响RNA干扰效率的一个重要因素是双链siRNA的稳定性。我们猜测：RNA解旋酶的抑制剂可以通过抑制RNA干扰途径中的解旋酶家族蛋白，从而增强双链siRNA的稳定性，实现对RNA干扰效果的增强。　　 氟化喹诺酮类化合物因为具有抑制细菌Ⅱ型拓扑异构酶(例如：革兰氏阴性细菌中的DNA解旋酶以及革兰氏阳性菌中的DNA拓扑异构酶Ⅳ)活性而被作为广谱抗生素使用。本实验室张强哲和张彩红老师已经得到依诺沙星对RNA干扰有增强效应的结论。在此基础上，我的工作主要有以下三个部分：　　 一、对于依诺沙星增强RNA干扰的靶标做出了进一步的猜测和论证：通过在HEK293A细胞体系中过量表达人体RNA解旋酶A(RHA)，得到RHA与依诺沙星对于RNA干扰的共激活效应，并且这种效应也是具有浓度依赖性的。这为探寻依诺沙星增强RNA干扰效应的靶标提供了证据；　　 二、将人体RNA解旋酶A按照功能结构域分别构建在真核表达载体中，在HEK293A细胞体系中验证不同结构域的过量表达与依诺沙星对于RNA干扰的协同增强效应。实验结果显示：不同功能结构域与依诺沙星的协同增强效应不如RHA全酶的增强效应明显，但是个别结构域(如：RGG box)对RNA干扰有增强效应。这为我们进一步探索RNA干扰途径中人体RNA解旋酶A(RHA)的功能提供了手段；　　 三、人体RNA解旋酶A(RHA)的原核表达纯化：通过对不同原核表达载体和菌株的选择和尝试，我们得到了以包涵体表达的全长人体RNA解旋酶A。并尝试了初步的变性纯化和复性手段，但是遗憾的是我们没有得到具有活性的全长RHA。这也为我们尝试利用大肠杆菌体系表达和纯化大分子量，含有较多稀有密码子的真核蛋白提供了一些思路。