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柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing, HLB)和柑橘衰退病(Tristeza)是世界柑橘产业的两大主要毁灭性病害,近年来发生加重。前者在近50个国家有发生,后者分布更广。2004和2005年分别在巴西和美国发现黄龙病,该病已使佛罗里达柑橘产业产量锐减一半,引起了政府和科研工作者的高度关注。现已知黄龙病病原为韧皮部杆菌属细菌,可分为三个暂定种：亚洲种(’Candidatus Liberibacter asiaticus’,CaLas)、非洲种(’Ca. L.africanus’,CaLaf)和美洲种(’Ca. L. americanus’, CaLam),目前,CaLas是分布最广危害最大的一个种。该病菌可通过嫁接和木虱(Diaphorina citri, Trioza erytreae and Cacopsylla citrisuga)传播,几乎能侵染所有柑橘类植株,植株感病后,叶片主要表现斑驳黄化、均匀黄化和缺素黄化症状,果实着色不均、畸形、红鼻果,产量减少及果实品质降低,给产业带来巨大经济损失。衰退病病原为长线形病毒科(Closteroviridae)下长线形病毒属(Closterovirus)的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV),可通过嫁接和蚜虫(Toxoptera citricidus,T. aurantii, Aphis gossypii, A.spiraecola and Myzus persicae)传播,是目前已知基因组最大的植物病毒之一。根据衰退病毒侵染指示植物表现的症状,可分为强毒株系和弱毒株系,根据其引起指示植物表现的症状可分为三种类型：速衰型(Quick decline, QD)、茎陷点型(Stem pitting, SP)和苗黄型(Seeding yellow, SY)。柑橘植株被CaLas或CTV强毒株系单独侵染或两者复合侵染后会产生一些相似症状,如叶片黄化、固化、船型叶,根系衰退,韧皮部坏死等,而被衰退病毒弱毒株系侵染后,几乎对寄主没有影响。目前,没有抗黄龙病的柑橘品种,也无特效防治药剂,一旦感染,最有效的办法是砍除病树,而CTV强毒株系可以通过抗病品种或弱毒株系交叉保护措施到达一定防控效果。本文对接种CaLas的甜橙植株进行病理解剖,系统观察其细胞病变情况,以期从细胞水平上阐释该菌对甜橙植株的影响；通过观察CaLas分别和CTV强弱毒株系复合侵染甜橙植株后的生物学症状,探索病原间及其与寄主的表型互作关系；进一步对甜橙植株分别在CaLas和CTV强弱毒株系胁迫条件下的转录组学开展对比研究,以期从转录分子水平了解韧皮部系统性寄生病原对甜橙植株的影响和植株对病原的应对反应,从而利于对病原-寄主互作的分子机理以及从转录分子水平上对生物学结果的理解,研究结果可为寻找黄龙病防控新途径奠定一定的理论基础。现将本文研究结果摘要如下：1.世界上首次在柑橘样品中观察到CaLas噬菌体,对CaLas感染甜橙的细胞病变观察更为系统。通过电镜观察发现CaLas噬菌体,这是世界上首次在柑橘细胞中观察到噬菌体的直接证据,噬菌体的存在形式可能与CaLas在植株体内的浓度相关。大量淀粉粒和嗜锇颗粒分别在叶绿体内和叶绿体表面积累,胼胝质在胞间连丝孔隙单元(PPUs)堆积以及异形晶体细胞形成。淀粉粒与植物体内碳水化合物代谢相关,嗜锇颗粒与生物胁迫相关,胼胝质的积累与植物早期防御反应相关,异形晶体细胞与钙浓度相关,钙能够调控植物体内细胞信号传导和激发依赖钙的植物防御反应,如胼胝质的形成。因此在CaLas胁迫下,植物体内的碳水化合物和钙离子代谢失衡,胼胝质相关的植物早期防御系统被激活。2.衰退病毒弱毒株系CTV-B2在甜橙植株定殖后显著降低HLB的发生率和症状。通过实验组Ⅰ同时复合嫁接CTV-B2/CaLas-B232、衰退病毒强毒株系CTV-B6/CaLas-B232及CTV-B2/CTV-B6,与实验组Ⅱ先嫁接CaLas-232,待其在植株中定殖后,再嫁接CTV的比较发现：组Ⅰ中,CTV先于CaLas-B232在植株中定殖,并对之后CaLas-B232的定殖有一定影响,尤其是CTV-B2显著降低了HLB的发生率；组Ⅱ中CaLas-B232在植株中的定殖对之后CTV-B2和CTV-B6的定殖均没有影响；同时复合嫁接CTV-B2/CTV-B6时,对相互间的定殖也没有影响。此外,再次证明CaLas在根中的定殖先于叶,这预示根可作为该病早期检测的有效部位。3.甜橙植株分别被三个病原胁迫后差异表达基因的数量和转录组变化的复杂性,均与相应病原引起症状的复杂性具有一致性。与健康植株相比,甜橙植株分别被CTV-B2、CTV-B6和CaLas-B232胁迫后,上调表达基因比下调表达基因多；CaLas-B232胁迫甜橙植株差异表达的转录本(589个转录本上调表达,22个转录本下调表达),是CTV-B6胁迫甜橙植株差异表达转录本(328个转录本上调表达,76转录本下调表达)的1.5倍,是CTV-B2胁迫甜橙植株差异表达转录本(243个转录本上调表达,42个转录本下调表达)的2倍。三个病原均为韧皮部专性寄生病原,植株被CaLas-B232胁迫后,产生的症状最为复杂,如叶片斑驳黄化、均匀黄化、缺素黄化和固化,红鼻果和斜果,韧皮部坏死,根系退化等；被CTV-B6胁迫甜橙植株产生的症状复杂性次之,包括叶片黄化、固化,韧皮部坏死等,被CTV-B2胁迫后几乎没有影响。所以,三个病原分别胁迫甜橙植株的差异表达基因的数量,在一定程度上反映了相应病原胁迫甜橙植株产生症状的复杂性。CTV-B6和CaLas-B232分别胁迫甜橙植株的共同差异表达基因数,比两个CTV株系或组合I(CTV.B2和CaLas-B232)分别胁迫甜橙植株的量要大,且GO功能相似性亦大。其中,被三个病原分别胁迫而共同上调表达的有50个转录本,共同下调表达的有2个转录本；CTV-B6和CaLas-B232分别胁迫甜橙植株共同差异表达的转录本(105个转录本上调表达,2个转录本下调表达)约是两个CTV株系(27个转录本上调表达,0转录本下调表达)或组合Ⅰ(22个转录本上调表达,3个转录本下调表达)分别胁迫甜橙植株共同差异表达转录本的3.5倍。同时,通过PlantGSEA的GO功能富集差异表达基因发现：CTV-B6和CaLas-B232分别胁迫甜橙植株的差异表达基因主要与多种生物学过程(BPs)相关,如生物胁迫、防御反应、信号传导,而CTV-B2胁迫甜橙植株差异表达的基因主要与分子功能(MFs)和细胞成分(CCs)相关。由于CTV-B6和CaLas-B232分别胁迫甜橙植株产生症状的相似性比两个CTV株系或组合1分别胁迫甜橙植株产生症状的相似性大,所以转录组水平变化的相似性一定程度反映了相应病原胁迫甜橙植株产生症状的相似性。4.甜橙植株分别被三个病原胁迫后,其生理系统和离子代谢失衡,多种相似植物防御反应被激活,但有差异。通过分析差异表达基因发现,与生理系统相关的基因如PRR5、PRR7、GI分别被三个病原胁迫差异表达,表明甜橙植株分别在三个病原,尤其是CTV-B6胁迫下,生理系统严重受到影响。同时,Zn、Cu和Ca等离子相关转运蛋白基因的差异表达,表明植株体内相关离子代谢失衡。尽管分别在三个病原胁迫下,甜橙植株的多种相似防御反应机制被激活,但存在一定差异：1)与细胞壁和次生产物代谢相关的防御反应在CTV-B2胁迫甜橙植株中表现得更显著,2)与转录因子调节相关的防御反应在CTV-B6胁迫甜橙植株中表现的更显著,3)与激素调控、信号传导和抗病蛋白相关的防御反应在CaLas-B232胁迫甜橙植株中表现的更显著。5.甜橙植株被黄龙病菌胁迫后转录组水平变化与电镜观察到的细胞病变具有一致性。黄龙病菌胁迫甜橙植株后引起植株胼胝质合成和Zn离子转运蛋白等相关基因的差异表达,与电镜观察到的黄龙病菌胁迫甜橙植株后引起的胼胝质的积累及缺锌症状相呼应。6.Gfold与RT-qPCR结果具有一致性。Gfold是用于分析RNA-seq数据的程序,可通过计算基因的倍数变化找出差异表达基因。该程序基于Poisson分布设计,将基因长度和表达量同时考虑,避免了基因低表达量、高差异性或高表达量、低差异性的缺点,尤其适用于没有重复测序数据的样品。根据Gfold值和基因功能筛选了38个基因进行RT-qPCR检测和2-ΔΔCT算法计算基因的相对表达量,进一步通过Spss16.0计算Gfold值和RT-qPCR值之间的决定系数,分别为0.82(CTV-B2)、0.69(CTV-B6)和0.81(CaLas-B232),结果表明Gfold与RT-qPCR结果的一致性较好,从而证实通过Gfold分析RNA-seq数据得到的结果在生物学分析上具有可靠性。