研究背景:恶性肿瘤是全世界都面临的重大疾病难题,具有较高的发病率和死亡率,尤其相对于我国这样一个人口大国,每年因为癌症死亡的人数达数百万,严重威胁了人们的生命健康。因此,针对恶性肿瘤寻找相应的有效药物是现代研究者的使命和任务。近年来,从天然产物中寻找以及开发新的抗肿瘤药物一直是科学家们的研究热点方向。甘草次酸是中药甘草中的五环三萜类有效成分,国内外研究表明其具有作为先导化合物进行优化并发挥抗肿瘤作用的应用前景。课题组前期关于甘草次酸已经合成了 100余个衍生物,本研究是作为甘草次酸衍生物延续性合成及活性评价的研究,结合前期关于甘草次酸以及相关文献研究表明,在甘草次酸C-30位引入亲酯基团能显著增强甘草次酸的抗肿瘤活性,且课题组前期研究表明将氨基酸与三萜类化合物拼合后能够提高其对肿瘤的抑制作用,同时可有效改善药物的溶解性、选择性等特性。研究目的:本课题基于实验室前期关于甘草次酸的修饰方法以及相关文献进行设计:1)C-3位羟基变氨基;2)甘草次酸C-30位引入亲酯基团苄基,在C-3位羟基或氨基引入小分子氨基酸,得到两个系列(酯键和酰胺键)成键方式的甘草次酸衍生物,结合抗肿瘤活性筛选,探究成键方式对活性影响,以期得到活性显著提升的先导化合物;同时,对3位氨基差向异构问题深入研究,为今后学者关于甘草次酸的衍生化提供重要参考。研究内容:本实验合成甘草次酸衍生物36个,主要分为两个系列:1)3位酯键衍生物,以甘草次酸为母核在C-30位引入苄基同时在C-3位羟基与不同小分子氨基酸酯化连接,GA-OH系列(GO,C-3位为酯键);2)3位酰胺键衍生物,将甘草次酸C-3位羟基变成氨基得到3-氨基甘草次酸GA-NH2(GN),以此为母核同理引入苄基和氨基酸,GA-NH2系列(GN,C-3位为酰胺键)。研究过程中对以往被忽视的中间产物GN-BN差向异构体进行分离、结构确证以及活性评价。所有甘草次酸衍生物均通过1H-NMR、13C-NMR、HRMS等方法进行结构确证,并测量其熔点,旋光等物理参数。选取四种肿瘤细胞(A549肺癌细胞、Hela宫颈癌细胞、HepG2肝癌细胞及MCF-7乳腺癌细胞)和一种正常细胞(MDCK犬肾上皮细胞),利用MTT实验评价衍生物活性和毒性,;通过细胞染色示踪药物对肿瘤细胞形态的影响,并结合流式细胞仪初步探究优势化合物的抗肿瘤机制,以期为后续学者关于甘草次酸乃至五环三萜类的结构修饰提供参考。研究结果:本文共合成两个系列甘草次酸衍生物36个,其中新化合物32个,所有化合物通过MTT实验筛选了其抗肿瘤活性。构效关系分析结果显示:1、脱Boc甘草次酸衍生物活性均优于未脱Boc衍生物,同时,以酰胺键连接的甘草次酸衍生物活性均优于酯键连接的衍生物;2、连接氨基酸时氨基的暴露对化合物活性起到关键作用,大部分对不同肿瘤细胞活性能达到5μM以下,较原料药活性提升数十倍;3、差向异构体3α-GN-BN与3β-GN-BN得到分离和结构确证,且研究发现二者在抗肿瘤活性无明显差异。经MTT评价,化合物29为优势化合物(IC50A549=2.109±0.11μM),细胞染色和分子生物学初探该化合物细胞毒机制为:促使A549细胞核碎裂,诱导该细胞发生早期凋亡,阻滞细胞分裂停留在S期,多途径诱导肿瘤细胞凋亡。研究结论:本课题为延续性开展甘草次酸衍生物设计、合成和活性表征研究,探究成键方式变化和引入小分子氨基酸对甘草次酸的活性改善作用,总结构效关系发现所有酰胺键连接的化合物活性均优于酯键连接的化合物,同时脱Boc化合物活性均得到显著提升,可推断氨基的暴露对甘草次酸衍生物是否具有活性起到决定性作用,筛选出的最优化合物29能够诱导肿瘤细胞早期凋亡,且证明了合成过程中产生易被忽视的中间产物3α-GN-BN与3β-GN-BN,二者在抗肿瘤活性上差别不明显。上述研究可以得出C-3成键方式对甘草次酸的活性具有一定改善作用,且化合物经过此类结构修饰活性明显增强,同时不改变甘草次酸的诱导凋亡作用。研究结果达到课题研究目的,对后续学者关于甘草次酸乃至五环三萜的研究具有重要参考价值。