论文部分内容阅读
目的本研究拟阐明微小RNA-494（microRNA-494,miR-494）、受体相互作用蛋白激酶1（Receptor interacting protein-1,RIPK1）表达水平与癫痫海马神经元损伤的关系,并证明miR-494通过靶向下调RIPK1的表达,抑制NF-κ B信号通路的活性,促进神经元细胞增殖、抑制细胞凋亡,延缓癫痫（Epilepsy,Ep）进展,进而对癫痫海马神经元损伤发挥保护作用的机制。方法1.收集颞叶癫痫患者的脑组织颞叶海马区标本,定量PCR检测miR-494、RIPK1 mRNA的表达水平;分析miR-494表达水平与RIPK1的关系,分析miR-494表达水平与患者病程、首次发作年龄、病因、是否合并其他疾病等的关系。2.建立氯化锂-毛果芸香碱癫痫大鼠模型,结合miR-494 agomir、RIPK1 siRNA和miR-494 agomir+oe-RIPK 1处理大鼠,观察大鼠的行为学和电脑图改变,HE染色、电镜检查、尼氏染色、FJC染色观察海马神经元细胞损伤,Hoechst 33342染色、Tunnel染色观察海马神经元凋亡,定量PCR和Western Blot检测海马神经元NF-κB信号通路活化情况。3.体外分离新生SD大鼠原代神经元细胞,用无镁细胞外液诱导建立EP样神将元模型。双荧光素酶报告基因证明miR-494和RIPK1的相互作用;分别用miR-494 agomir、RIPK1 siRNA和miR-94 agomir+oe-RIPK1处理EP样神将元细胞,MTT检测细胞增殖、Hoechst 33342染色和流式检测细胞凋亡,定量PCR和Western Blot检测NF-κB信号通路活化,通过体外研究观察miR-494、RIPK1的表达水平对Ep样神经元细胞增殖、凋亡和细胞中NF-κB信号通路活化的影响。结果1.癫痫患者颞叶脑组织中的miR-494表达水平是对照组的（0.71±0.22）倍（p<0.05）;RIPK1表达水平是对照组的（1.89±0.28）（p<0.05）。其颞叶脑组织中miR-494和RIPK1 mRNA水平之间存在负相关性,r=0.6578,p<0.001。2.病程≤5年组、5-10年（含）组和>10年组患者脑组织miR-494 mRNA相对表达量为（0.82±0.19）、（0.61±0.15）和（0.43±0.11）,病程长的患者miR-494水平低于病程短的患者（p<0.05）。3.首次癫痫发作年龄<18岁的患者miR-494相对表达水平为（0.65±0.10）,首次癫痫发作年龄≥18岁的患者miR-494相对表达水平为（0.82±0.12）,首发年龄小的患者miR-494水平低于首发年龄大的患者（p<0.05）。4.利用氯化锂-毛果芸香碱诱导大鼠癫痫建模成功率为95%。Ep组大鼠脑电图的棘慢波数量较正常对照组明显增加（p<0.05）;agomir-miR-494组和RIPK1-siRNA组的棘慢波数量较agomir-NC组和siRNA-NC组明显减少（p均<0.05）;agomir-miR-494+oe-RIPK1 组的棘慢波数目与 agomir-miR-494 组相比明显增加（P<0.05）。5.HE染色显示,正常组大鼠神经元细胞排列整齐、结构完整、形态正常;Ep组、agomir NC组和siRNA-NC组神经元细胞呈三角形,胞质浓缩,出现核分裂和隐性核仁;agomir-miR-494组和RIPK1-siRNA组海马神经元损伤程度较Ep组有所减轻;agomir-miR-494+oe-RIPK1组的损伤程度较agomir-miR-494组加重。6.电镜显示,正常组大鼠的神经元染色质分布均匀,细胞核呈卵圆形,核仁清晰,超微结构正常。Ep组、agomir NC组和siRNA-NC组的大鼠神经元有大量异染色质,无粗面内质网和游离核糖体。Agomir-miR-494组和RIPK1-siRNA组大鼠神经元超微结构正常,有粗面内质网、核糖体和线粒体。Agomir-miR-494+oe-RIPK1组海马神经元损伤较agomir-miR-494组加重。7.尼氏染色结果显示,Ep组的神经元数量较正常组减少（p<0.05）。Agomir-miR-494 组和 RIPK1-siRNA 组神经元数量较 agomir-NC 组和 siRNA-NC 组增多（p均<0.05）;agomirniR-494+oe-RIPK1组的神经元数量较agomir-miR-494 组减少（p<0.05）。8.FJC染色显示,Ep组的FJC 阳性的变性神经元细胞较正常组增多（p<0.05）;agomir-miR-494组和RIPK1-siRNA组FJC阳性细胞数目较agomir NC组和siRNA-NC 组减少（p 均<0.05）;agomir-miR-494+oe-RIPK1 组的 FJC 阳性细胞较 agomir-miR-494 组增加（p 均<0.05）。9.TUNEL染色结果显示,Ep组凋亡神经元较正常组增加（p<0.05）。agomir-miR-494 组和 RIPK1-siRNA 组的阳性细胞较 agomir NC 组和 siRNA-NC 组减少（p 均<0.05）;agomir-miR-494+oe-RIPK1 组的阳性细胞较agomir-miR-494 组增加（p 均<0.05）。10.Hoechst 33258染色结果显示,Ep组细胞凋亡率较正常组升高（p<0.05）;Agomir-miR-494 组和 RIPK1-siRNA1 组的凋亡率较 agomir-NC 组和 siRNA-NC 组下降（p 均<0.05）;Agomir-miR-494+oe-RIPK1 组的凋亡率较 agomir-miR-494组升高（p均<0.05）。11.定量PCR和Western blot结果表明,与正常组相比,Ep组Bc1-2的mRNA和蛋白表达明显降低,而Bax的mRNA和蛋白表达却明显升高（p均<0.05）;agomir-miR-494 组和 RIPK1-siRNA 组的 Bc1-2 的 mRNA 和蛋白表达较 agomir-NC组和siRNA-NC组升高,而Bax的mRNA和蛋白表达降低（p均<0.05）;agomir-miR-494+oe-RIPK1 组的 Bc1-2 的 mRNA 和蛋白表达较 agomir-miR-494组下降,而Bax的mRNA和蛋白表达升高（p均<0.05）。12.定量PCR和Western Blot结果显示,与正常组相比,Ep组大鼠海马区miR-494 表达明显下降（p<0.01）,RIPK1 和 NF-κ Bp65 的表达增加（p<0.01）;agomir-miR-494 组的 miR-494 表达较 agomir-NC 组升高（p<0.01）,RIPK1 和 NF-κ Bp65 表达降低（p<0.01）。RIPK1-siRNA 组海马组织 RIPK1 和 NF-κ Bp65 的表达较 siRNA-NC 组降低（p<0.01）。agomir-miR-494+oe-RIPK1 组的 RIPK1 和 NF-κ Bp65 表达较 agomir-miR-494 组升高（p<0.05）。13.体外分离培养的大鼠海马神经元细胞在培养第1天即发生粘附;第3天时细胞体积开始变大;第7天细胞胞体变长,并且数目增加。神经元纯度鉴定结果表明,体外分离的海马神经元细胞纯度超过90%。14.MTT分析显示,Ep组神经元细胞生存能力较对照组下降（p<0.05）。miR-494 mimic组和RIPK1-siRNA组细胞存活力较mimic NC组和siRNA-NC组增强（p 均<0.05）,miR-494mimic+oe-RIPK1 组的细胞活力较 miR-494 mimic 组降低（p均<0.05）。15.Hoechst 33342染色显示,对照组细胞核呈圆形或椭圆形均匀染色,形态规则;Ep组、模拟NC组和siRNA-NC组神经元细胞均出现了角化变性、凋亡荧光信号增强、核碎裂和凋亡小体（p均<0.05）。MiR-494mimic组和RIPK1-siRNA组细胞凋亡较Ep组减少;miR-494 mimic+oe-RIPK1组凋亡细胞较miR-494 mimic组增加（p均<0.05）。16.Annexin V-FITC/PI双染结果表明,Ep组神经元的细胞凋亡率明显增加;miR-494 mimic组和RIPK1-siRNA组神经元的凋亡率明显低于mimic NC组和 siRNA-NC 组（p 均<0.05）;miR-494 mimic 组+oe-RIPK1 组神经元细胞的凋亡率明显高于miR-494 mimic组（p均<0.05）。17.定量PCR和Western blot结果表明,Ep组神经元细胞中Bcl-2表达水平明显降低,而Bax表达水平较对照组升高（p均<0.05）。miR-494 mimic组和RIPK1-siRNA组的神经元细胞中Bcl-2表达较mimic NC组和siRNA-NC组增加,Bax 表达却明显降低（p 均<0.05）。Bcl-2 表达在 miR-494 mimic 组+oe-RIPK1组明显低于miR-494 mimic组,Bax表达增升高（p均<0.05）。18.双荧光素酶报告基因检测显示,wt-miR-494报告基因载体和oe-RIPK1共转染的海马神经元细胞中荧光素酶活性降低较wt-miR-494报告基因载体和mimic NC组降低（p<0.05）,而mut-miR-494报告基因载体和oe-RIPK1共转染的海马神经元细胞中荧光素酶活性较mut-miR-494报告基因载体和oe-NC共转染的海马神经元细胞中荧光素酶活性无显著差异（p>0.05）。19.定量PCR和Western blot结果表明,Ep组miR-494表达较对照组降低,而RIPK1和NF-κ Bp65的表达则明显高于对照组（p<0.05）;miR-494 mimic组miR-494的表达水平明显高于mimic NC组,而RIPK1和NF-κ Bp65的表达明显降低（p<0.05）;RIPK1-siRNA 组的 RIPK1 和 NF-κ B p65 表达明显低于 siRNA-NC组（p<0.05）;miR-494 mimic+oe-RIPK1 组的 RIPK1 和 NF-κ B p65 表达较miR-494 mimic 组增加（p<0.05）。结论1.癫痫患者脑组织中miR-494表达降低,RIPK1表达升高,miR-494水平与患者的病程和首次发作时年龄有关,提示miR-494是一个癫痫有关的因子2.miR-494能抑制RIPK1表达,进而引起NF-κ B信号通路的失活,导致Ep大鼠海马神经元细胞增殖能力上升,细胞凋亡被抑制,从而减轻神经元损伤和Ep进展。