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结核病曾长期在许多国家和地区肆虐,夺去全球数亿人的生命。直到有效结核药物问世并发展了化学疗法后,结核病疫情才逐渐下降。然而近年来,由于全球人口的迅速增长,人口流动加速、耐药菌株增多等种种原因,造成结核病卷土重来。因此,近年来结核病的发病机制及防治工作再度受到人们的重视。对其机制的深入研究将有助于我们对结核病本身和其他疾病的认识,也为这类疾病的防治提供新的思路。本次实验研究结核杆菌的多种菌株在动物实验中诱发宿主巨噬细胞凋亡的相关机制,同时对相关信号通路的蛋白进行检测以初步判断在感染早期中主导巨噬细胞凋亡的因素及机制。 取在罗氏培养基生长良好的人型结核分枝杆菌H37Rv株、H37Ra株以及BCG 2-3周的培养物,用生理盐水配置成菌悬液(1mg/mL);经尾静脉给每只小鼠注射同等剂量的菌悬液0.3mL(相当于湿菌0.3mg/只)后,在不同感染时间段1、3、5、7、9、11、13、15天取出感染小鼠的肺泡灌洗液;分离出肺泡巨噬细胞,并利用70%乙醇溶液、2%戊二醛溶液和4%多聚甲醛溶液固定小鼠肺泡灌洗液中的巨噬细胞。然后利用透射电镜和荧光染色观察凋亡巨噬细胞的形态学特征;在生化水平上利用琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞DNA片断化水平;流式细胞术测定不同感染时期小鼠巨噬细胞凋亡率;同时通过流式细胞术观察巨噬细胞膜Toll样受体2(TLR2)和胞内Bcl-2蛋白的表达。 结果显示:H37Rv组样本的超薄切片中,呈凋亡改变的细胞数目较多,且多见于感染5天后,凋亡细胞胞体变小,呈圆形或椭圆形,核膜明显扩张,核内染色质浓聚趋边,胞质内细胞器减少。Hochest33258染色之后凋亡阳性细胞体积缩小,核呈蓝紫色,可见浓缩的染色质紧贴核膜内侧或核质成碎片状。H37Rv组中呈凋亡阳性的细胞较多,H37Ra组、BCG组以及正常对照组中也有少量呈凋亡改变的胞核存在,但比例极低,可能是细胞代谢等正常的生理现象。DNA电泳结果显示只有H37Rv株感染的小鼠巨噬细胞出现了凋亡细胞特征性的阶梯状(ladder pattern)的DNA电泳条带,梯状条带对应于感染5天和7天时的小鼠样本,其余时间段及仅有少量DNA片断被提取出来。流式细胞术显示H37Rv组中巨噬细胞