背景和目的：神经病理性疼痛是慢性难治性疼痛的常见类型，主要由中枢或外周神经系统损伤或疾病所引起，表现为自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏。中枢敏化是神经病理性疼痛产生的基础，前扣带回皮层（anterior cingulate cortex，ACC）作为与慢性疼痛相关的关键脑区，其可塑性变化是中枢敏化的重要体现。细胞周期末期促进复合物（anaphase promoting complex，APC）与其调节亚基Cdh1是细胞内泛素-蛋白酶体系统中重要的E3泛素连接酶，最近研究显示其在谷氨酸敏感性、突触功能及神经元存活的调控中起着重要作用。但其是否参与神经病理性疼痛 AC C可塑性机制，尚不清楚。　　本研究拟观察神经病理性疼痛大鼠ACC区APC-Cdh1及其下游底物的表达变化规律。通过构建表达Cdh1基因的重组慢病毒载体，上调该脑区APC-Cdh1活性。分别从行为学、形态学及分子水平观察慢病毒干预对ACC谷氨酸受体密度、突触形态功能及神经元存活的影响和机制，探讨APC-Cdh1在神经病理性疼痛ACC可塑性变化中的作用。　　方法与结果：　　1.神经病理性疼痛大鼠ACC区APC-Cdh1表达变化与痛觉超敏的关系　　方法：实验一（神经病理性疼痛大鼠ACC区APC-Cdh1的表达变化）：雄性SD大鼠48只，体重180-220g，随机分为2组（n=24）。1)假手术组（Sham组）：仅暴露坐骨神经及其分支；2)神经病理性疼痛模型组（SNI组）：参照Decosterd等方法，选择性损伤坐骨神经其下分支中的胫神经及腓总神经，保留腓肠神经，建立大鼠坐骨神经保留性损伤（spared nerve injury，SNI）模型。通过观察模型大鼠痛觉行为学变化，免疫组化检测大鼠 ACC疼痛相关蛋白c-Fos的表达，证实模型构建成功。模型建立后3、7、14 d，采用免疫组化及Western blot法检测两组大鼠ACC区APC-Cdh1、下游底物Skp2、SnoN及其上游调节激酶Cdk5/p35的表达。　　实验二（ACC立体定位注射Cdh1过表达慢病毒对神经病理性疼痛大鼠痛阈的影响）：参照大鼠脑立体定位图谱（Paxinoset al.,2005），确定ACC坐标，分别将Cdh1过表达慢病毒（Lenti-Cdh1）及对照慢病毒（Lenti-control）通过立体定向注射入大鼠ACC（10μl，滴度2×108TU/ml）。慢病毒感染后3d，快速断头取脑，避光制作冰冻切片，荧光显微镜下观察ACC绿色荧光蛋白（GFP）的表达；分离ACC，提取总蛋白，Western blot法检测Cdh1外源性融合蛋白的表达，评价各型慢病毒在体感染情况。18只雄性SD大鼠，随机分为1)Sham+ saline组：假手术后7d，ACC立体定位注射0.9％氯化钠溶液（n=6）；2)SNI+ Lenti-control组：SNI模型建立后7d，ACC立体定位注射Lenti-control（n=6）；3)SNI+ Lenti-Cdh1组：SNI模型建立后7d，ACC立体定位注射Lenti-Cdh1（n=6）。模型建立前至慢病毒感染后14d采用von Frey细丝法测定三组大鼠机械痛阈的变化。　　结果：术后1、3、7、14d，SNI组50%机械性缩爪阈值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）显著下降，与Sham组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫组化检测显示，SNI组术后3、7、14d，ACC疼痛相关蛋白c-Fos表达明显增加，从组织学上进一步证明了SNI模型构建的成功。免疫组化、Western blot检测发现，SNI大鼠术后3、7、14d，ACC区Cdh1总蛋白及APC主要成分APC2表达减少，且部分Cdh1出核转入细胞浆表达；Cd h1下游底物Skp2、S noN表达升高，上游负性调节激酶Cdk5/p35表达明显增加，与Sham组比较，统计学差异显著（P<0.05）。Cdh1过表达慢病毒Lenti-Cdh1 ACC内立体定位注射，上调APC-Cdh1活性可部分缓解大鼠神经病理性疼痛痛觉超敏，与对照慢病毒Lenti-control相比，SNI+Lenti-Cdh1组慢病毒注射后7d50%PWMT上升，并持续至慢病毒注射后14d，统计学差异显著（P<0.05）。　　2.APC-Cdh1活性调节对神经病理性痛大鼠ACC神经元突触可塑性的影响及机制方法：实验一（神经病理性疼痛大鼠ACC突触可塑性变化）：成年雄性SD大鼠54只，随机分为2组。1)Sham组：仅暴露坐骨神经及其分支（n=27）；2)SNI组：结扎并切断左侧胫神经及腓总神经，保留腓肠神经（n=27）。术后3、7、14d，紫外比色法测定大鼠ACC内兴奋性氨基酸谷氨酸的含量，免疫荧光法检测突触功能蛋白的表达变化，并分别提取ACC总蛋白及膜蛋白，Western blot法分析检测不同时间点突触后各型谷氨酸受体的表达情况。　　实验二（APC-Cdh1与神经病理性疼痛大鼠ACC神经元突触可塑性变化的关系）：30只成年雄性SD大鼠，随机分为Sham组（n=15）和SNI组（n=15），参照Decosterd等方法，选择性损伤坐骨神经分支，建立大鼠神经病理性疼痛SNI模型。分别于模型建立后3、7d，采用免疫荧光和Western blot法检测SNI模型大鼠ACC区Cdh1相关蛋白EphA4的表达特点。并于术后第14d，利用免疫共沉淀技术，观察Cdh1相关蛋白EphA4与APC-Cdh1及各型谷氨酸受体之间的相互作用。　　实验三（慢病毒过表达Cdh1蛋白对神经病理性疼痛大鼠ACC神经元突触可塑性的影响）：成年雄性SD大鼠24只，建立SNI神经病理性疼痛模型，随机分为Sham组（n=6）、SNI组（n=6）、SNI+Lenti-control组（n=6）和SNI+ Lenti-Cdh1组（n=6）。SNI+Lenti-control组及SNI+Lenti-Cdh1组于模型建立后7d分别将Lenti-control及Lenti-Cdh1慢病毒通过立体定向注射入大鼠ACC（10μl，滴度2×108TU/ml）。慢病毒注射后14d，透射电镜观察大鼠ACC突触形态结构的变化。给予慢病毒后3、7、14d，Western blot检测ACC突触功能蛋白PSD95、Cdh1相关蛋白EphA4及谷氨酸受体GluR1的水平，评价APC-Cdh1活性调节对ACC突触可塑性的影响。　　结果：术后3、7、14d，SNI组大鼠ACC内谷氨酸含量，突触功能蛋白突触素Syn1、PSD95及NMDA受体NR2B亚型的表达，与Sham组相比明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；GluR1-AMPA受体总表达量，两组间无明显差异（P>0.05），但其胞膜表达量显著增加，与Sham组相比，差异显著（P<0.05）。Western blot和免疫荧光染色显示，SNI术后3、7d，与Sham组相比，SNI组ACC区APC-Cdh1相关蛋白EphA4表达降低（P<0.05）。免疫共沉淀检测发现，EphA4与Cdh1、APC主要成分APC2及谷氨酸受体GluR1间存在相互作用。与Sham组相比，SNI组大鼠ACC线粒体肿胀、突触后致密物增厚，突触间隙变窄。而ACC内立体定位注射Cdh1过表达慢病毒Lenti-Cdh1可逆转上述SNI导致的突触结构的改变。SNI+Lenti-Cdh1组慢病毒注射后7、14d，ACC内EphA4表达升高，PSD95及GluR1表达明显减少，与SNI+Lenti-contro l组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。　　3.ACC神经元存活与神经病理性疼痛大鼠痛觉超敏的关系　　方法：　　实验一（神经病理性疼痛大鼠ACC神经元凋亡及存活的变化）：SD雄性大鼠24只，体重180-220g，随机分为Sham组（n=12）及SNI组（n=12）。术后3、10d采用神经元特异性核蛋白NeuN标记神经元，通过免疫荧光和Western blot法检测ACC神经元的变化，并利用TUNEL技术及active caspase-3（Casp-3a）/NeuN免疫荧光双标染色观察模型建立后10 d大鼠ACC神经元的凋亡情况。　　实验二（凋亡抑制剂TUDCA对神经病理性疼痛大鼠ACC神经元存活及痛阈的影响）：36只SD雄性大鼠，随机分为3组（n=12）。1)Sham组：仅暴露左侧坐骨神经及其分支；2) SNI+saline组：SNI术前3d至术后隔日腹腔注射0.9%氯化钠溶液；3)SNI+ TUDCA组：SNI术前3d至术后隔日腹腔注射TUDCA（300mg/kg）。采用von Frey细丝法测定3组大鼠50% PWMT，评价痛觉行为学变化。术后10d，NeuN标记神经元，谷氨酸脱羧酶65/67（GAD65/67）标记GABA能抑制性神经元，免疫荧光及Western blot法检测ACC神经元的变化，并利用TUNEL染色观察神经元的凋亡情况。　　结果：SNI组大鼠术后10dACC神经元数量明显减少，与Sham组相比，差异显著（P<0.05），且残存神经元排列松散，TUNEL染色可见大量凋亡细胞。Casp-3a/NeuN荧光双标检测显示，SNI术后10d，大鼠ACC内表达Casp-3a的神经元明显增多。术后4d，SNI+TUDCA组大鼠较SNI+saline组，50% PWMT明显升高，持续至术后10d，差异具有统计学意义（P<0.05）。与SNI+saline相比，SNI+TUDCA组ACC神经元数量显著增多（P<0.05），且TUNEL阳性凋亡细胞明显减少。免疫荧光、Western blot结果显示，SNI术后大鼠ACC内GAD65及GAD67蛋白表达降低；而TUDCA可抑制上述SNI相关的GAD蛋白表达下调（P<0.05）。　　4.APC-Cdh1活性调节对神经病理性疼痛大鼠ACC神经元存活影响的初步研究方法：实验一（神经病理性疼痛大鼠ACC凋亡相关底物Cyclin B1的表达变化）：成年雄性SD大鼠24只，随机分为Sham（n=12）、SNI（n=12）两组。Sham及SNI神经病理性疼痛模型建立后10d，分别采用免疫荧光及Western blot法检测两组大鼠ACC内APC-Cdh1凋亡相关底物Cyclin B1的表达。　　实验二（慢病毒过表达Cdh1蛋白对神经病理性疼痛大鼠ACC神经元凋亡的影响）：36只成年雄性SD大鼠，180-220g，随机分为Sham组（n=12）、SNI+Lenti-control组（n=12）及SNI+Lenti-Cdh1组（n=12）。后两组大鼠SNI模型建立前3d，ACC分别立体定位注射Lenti-control及Leni-Cdh1慢病毒载体。SNI术后10d，TUNEL染色观察ACC神经元凋亡情况，Western blot检测Casp-3a及APC-Cdh1凋亡相关底物Cyclin B1的表达。　　结果：免疫荧光、Western blot法检测发现，模型建立后10d，SNI组ACC内APC-Cdh1凋亡相关底物Cyclin B1表达与Sham组相比，明显增多，差异具有统计学意义（P<0.05）。而Cdh1过表达慢病毒Lenti-Cdh1注射入ACC，上调其内APC-Cdh1活性，可降低凋亡相关底物Cyclin B1的表达；抑制SNI引起的ACC神经元凋亡，与对照慢病毒组相比，SNI+Lenti-Cdh1组大鼠ACC内TUNEL阳性凋亡细胞数量明显减少，Casp-3a蛋白表达显著下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。　　5.统计学处理　　数据以均数±标准差（x±s）表示，SPSS18.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。　　结论：　　1.神经病理性疼痛大鼠ACC内APC-Cdh1活性下调，通过Cdh1过表达慢病毒上调其活性，可以部分缓解大鼠神经病理性疼痛。　　2.APC-Cdh1可通过与EphA4相互作用泛素化降解突触后AMPA受体亚基GluR1，调控谷氨酸兴奋性突触信号传递，参与神经病理性疼痛ACC中枢敏化的形成。　　3.ACC内GABA能神经元凋亡与神经病理性疼痛痛觉超敏的维持密切相关，Caspase-3通路介导的GABA能神经元凋亡丢失是ACC可塑性改变的重要体现。　　4.APC-Cdh1可能通过作用于底物蛋白Cyclin B1，调控神经病理性疼痛大鼠ACC神经元存活，影响ACC可塑性，参与中枢敏化的形成。