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番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的典型成员。ToMV为单链正义RNA病毒，基因组长度约为6.4kb；ToMV的寄主范围十分广泛，是一类世界性分布的最具有经济重要性的植物病毒之一。目前国内外对于ToMV的研究主要集中在其功能蛋白与寄主的互作上，本研究构建ToMV的农杆菌侵染性克隆研究病毒引起番茄系统性坏死的分子机制。基于周雪平等(1993)发现的ToMV-S1株系和由本实验室保存ToMV-N5株系在番茄(合作903)引起不同表型，而两者的序列以及氨基酸相似性分别高达98.8%和97.2%。本研究以两个株系的病毒粒子RNA为模板，采用RT-PCR扩增其全长的基因组，并通过分段克隆的方法将ToMV的基因组克隆到携带有35S启动子的载体pCB301中，阳性克隆pToMV-N5和pToMV-S1分别转化到农杆菌GV3101中，并浸润接种于本氏烟和番茄中。pToMV-S1和pToMV-N5浸润接种的本氏烟3天后均开始出现顶端新生叶片萎焉症状，7天后整棵植株死亡。pToMV-N5农杆菌侵染性克隆接种番茄（合作903）7天后顶端新生叶片开始出现褐色斑点并逐渐导致植株生长停滞，严重者导致植株整棵系统死亡；而pToMV-S1接种寄主14天未见明显症状，后期逐渐表现为轻花叶症状；在番茄的系统叶中Western blot均能检测到病毒的存在，但是pToMV-S1的病毒积累量低于pToMV-N5的含量。在2种寄主上，ToMV农杆菌侵染性克隆引起的症状反应均与与野生型病毒相一致，这表明pToMV-N5和pToMV-S1的农杆菌侵染性克隆构建成功。在获得2个病毒的农杆菌侵染性克隆的基础上，通过酶切连接的方法将ToMV的包含MP/CP区域进行相互交换，获得嵌合型病毒pToMV-N5MPCPS1以及pToMV-S1MPCPN5，接种本氏烟结果验证其具有侵染活性。含有ToMV-S1株系MP和CP的嵌合病毒（pToMV-N5MPCPS1）侵染性克隆浸润接种番茄合作90314天未出现ToMV-N5引起的系统性坏死症状，而仅仅表现为轻微的花叶症状；pToMV-S1MPCPN5引起番茄系统性坏死症状，与ToMV-N5在番茄上产生的症状反应相同。这表明ToMV-N5引起番茄系统性坏死表型可能与其MP、CP相关。为了进一步的确定ToMV-N5引起番茄系统性坏死的决定因子，本实验采用OverlappingPCR以及酶切连接的方法构建2个株系的MP互换的嵌合病毒pToMV-N5MPS1和pToMV-S1MPN5。病毒浸润接种结果表明，携带有ToMV-N5的MP的嵌合病毒pToMV-S1MPN5引起寄主植物出现了典型的系统性坏死症状，而携带有ToMV-S1株系MP的嵌合病毒pToMV-N5MPS1侵染性克隆接种番茄(合作903)14天没有明显表型，后期逐渐出现花叶症状。pToMV-S1MPN5与pToMV-N5的症状反应相一致，而ToMV-N5的MP被S1株系的MP取代后则表现为轻花叶症状，这表达ToMV-N5引起番茄系统性坏死与其MP相关。Northern blot分析病毒的基因组含量结果表明，pToMV-S1基因组含量低于pToMV-N5，而其MP被N5株系的代替后，pToMV-S1MPN5含量大大提高；与病毒的Western blot分析的结果相一致，这表明ToMV-N5的移动蛋白能够提高病毒的含量，而且ToMV-N5引起番茄系统性坏死可能是由其病毒含量高所引起。通过对ToMV-N5和ToMV-S1的MP比对发现其氨基酸同源性高达98.8%以上，仅在92位、170位和240位存在差异。因此本研究还构建了点突变的嵌合病毒并获得了其侵染性克隆，初步实验结果表明，两个株系在寄主上的症状差异并非由单一的氨基酸差异引起。