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【目的】恶性肿瘤最重要的生物学特性是侵袭和转移,这两种特性是导致肿瘤死亡的主要原因。目前研究表明,TGF-β和趋化因子及其受体参与肿瘤细胞的侵袭和转移,但在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中,TGF-β与趋化因子及其受体间是否存在关联以及其详细机制尚无报道。本课题拟探讨TGF-β1对MCF-7细胞趋化因子受体CXCR4和CCR7表达的影响。【方法和结果】一、重组人TGF-β1对乳腺癌细胞系MCF-7 CXCR4、CCR7表达的影响用1,10,100ng/ml三种浓度的rhTGF-β1刺激MCF-7细胞48h后1.乳腺癌细胞系MCF-7 CXCR4的表达1)mRNA表达:RT-PCR检测结果表明,实验组MCF-7细胞CXCR4 mRNA表达水平增高;实时定量PCR结果显示,与未刺激组相比,1ng/ml和10ng/ml的rhTGF-β1能使CXCR4的mRNA表达水平增加6倍左右,100ng/ml上调约10倍;2)蛋白水平的表达:与空载体对照组(16.59%)相比,流式细胞仪结果显示,用不同浓度rhTGF-β1处理后MCF-7细胞表面CXCR4的表达均升高,且呈浓度依赖性的方式上调CXCR4的表达,1ng/ml,10ng/ml和100ng/ml刺激组CXCR4的表达依次为20.67%,24.60%和47.68%;3)趋化作用:经rhTGF-β1刺激后,SDF-1α(CXCR4的配体)对刺激后的MCF-7趋化作用增强。2.乳腺癌细胞系MCF-7 CCR7的表达以上处理对CCR7的表达无明显影响。二、可溶性II型TGF-β受体(Fc:TβRII)对乳腺癌细胞系MCF-7 CXCR4、CCR7表达的影响(一)可溶性II型TGF-β受体(Fc:TβRII)真核表达载体的构建与表达1.可溶性II型TGF-β受体(Fc:TβRII)真核表达载体的构建通过PCR方法从pH2-3FF1(含人TGF-β受体Ⅱ全长序列)扩增编码TGF-β受体Ⅱ胞外功能区的基因,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1-hIg 2(含人IgG Fc段)中,命名为pcDNA3.1-TβRII-hIg。经双酶切鉴定及测序分析证实,所克隆和构建的人TβRII-hIg阅读框及连接部位序列正确,表明可溶性TGF-β受体Ⅱ胞外段与人IgG Fc融合基因(TβRII-hIg)的重组真核表达质粒构建成功。为了方便观察真核转染是否成功以及转染效率,将融合基因亚克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP中,经双酶切鉴定及测序分析证实,成功构建了含目的基因TβRII-hIg和EGFP的双表达载体pIRES2-EGFP-TβRII-hIg。2.可溶性II型TGF-β受体(Fc:TβRII)真核表达载体的表达采用Lipofectamine TM 2000将pIRES2-EGFP-TβRII-hIg载体转染MCF-7细胞,通过以下方法检测外源融合基因的表达1)利用倒置荧光显微镜观察示踪蛋白EGFP,结果显示转染细胞有绿色荧光蛋白的表达,提示转染成功;2)RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳可见约1200bp的特异性条带,与目的片段一致;3)利用抗人IgG抗体检测转染目的基因的MCF-7细胞总蛋白,Western blot结果显示分子量约41kD的特异性条带,与预期结果一致;4)ELISA检测MCF-7细胞培养上清中存在Fc:TβRII融合蛋白,并用人IgG作为标准品对Fc:TβRII进行定量检测。结果表明转染pIRES2-EGFP-TβRII-hIg的MCF-7细胞,细胞培养上清中融合蛋白表达量到第3天约为80ng/ml。(二)可溶性II型TGF-β受体(Fc:TβRII)对乳腺癌细胞系MCF-7 CXCR4、CCR7表达的影响将真核表达载体pIRES2-EGFP-TβRII-hIg转染MCF-7细胞48h后1. CXCR4 mRNA的表达RT-PCR检测结果表明,转染pIRES2-EGFP-TβRII-hIg的MCF-7细胞CXCR4mRNA的表达降低;实时定量PCR结果提示,转染pIRES2-EGFP-TβRII-hIg细胞组CXCR4 mRNA的表达显著降低,相当于pIRES2-EGFP载体组的17%左右。2. CXCR4蛋白的表达流式细胞仪分析结果显示,转染pIRES2-EGFP-TβRII-hIg的MCF-7细胞表面CXCR4表达显著低于pIRES2-EGFP组,分别为21.45%和31.8%。3.趋化功能趋化试验结果提示分泌性表达的融合蛋白Fc:TβRII可抑制SDF-1α对MCF-7细胞的趋化作用。4.乳腺癌细胞系MCF-7 CCR7的表达将真核表达载体pIRES2-EGFP-TβRII-hIg转染MCF-7细胞48h后,对CCR7的表达未见明显影响。三、CXCR4启动子萤火虫荧光素酶报告基因表达载体的构建与顺式作用元件的性质分析1.一系列5’端截短的CXCR4启动子萤火虫荧光素酶报告基因表达载体的构建提取外周血淋巴细胞基因组DNA,以其为模板,通过PCR扩增一系列5’端不同,而3’端相同的CXCR4启动子序列,将其克隆入无启动子的萤火虫荧光素酶报告基因的表达载体pGL3-basic中。经双酶切鉴定及测序分析证实,所克隆和构建的截短的人CXCR4启动子序列正确,表明构建成功。2.缺失试验分析CXCR4启动子-231bp区域的顺式作用元件将构建的一系列5’端截短的CXCR4启动子萤火虫荧光素酶报告基因表达载体分别与作为内参的pRL-TK(海肾荧光素酶报告基因表达载体)共转染MCF-7。通过检测萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶的表达活性,探索CXCR4启动子-231bp区域顺式作用元件的性质。结果提示从hcxcr4启动子上游距离转录启始位点194bp(-194)到-168之间,有发挥正向调控的顺式作用元件;紧接着有一个很强的负向调控元件存在于-168bp到-160bp之间;从-160bp到-75bp的区间内又有正向调控的顺式作用元件,为进一步对CXCR4表达调控机制研究奠定了良好的基础。【结论】以上结果表明,重组人TGF-β1刺激可上调乳腺癌细胞系MCF-7 CXCR4的表达;pIRES2-EGFP-TβRII-hIg真核表达载体转染MCF-7分泌性表达融合蛋白Fc:TβRII能下调乳腺癌细胞系MCF-7 CXCR4的表达;进一步成功构建了一系列5’端截短的CXCR4启动子萤火虫荧光素酶报告基因的表达载体,并分析了CXCR4启动子-231bp区域的顺式作用元件,为进一步对CXCR4表达调控机制研究奠定了良好的基础。