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肝癌是人类和动物常发的恶性肿瘤性疾病,其中肝细胞癌(HCC)在临床上的发病率最高,约占肝癌总发病率的70%-90%。目前,对于HCC的治疗主要采取姑息性手术治疗、化学药物治疗等方法,虽然这些方法具有一定的治疗效果,但同时具有高风险、毒副作用大、对机体损伤严重等弊端。因此,开发治疗HCC的天然新药物、提高药物作用于HCC的敏感性,是当前抗肿瘤药物研发的重点。银杏叶多糖(GBLP)是从银杏叶中提取出来的一种活性成分,它具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化等多种生物学活性。有研究表明,经硫酸化分子修饰后,许多中药多糖的抗肿瘤活性明显增强。因此,本研究采用氯磺酸-吡啶法制备了硫酸化银杏叶多糖(SGBLP),以肝癌HepG2细胞为试验模型,检测了SGBLP对HepG2细胞细胞活性、主要凋亡蛋白和自噬蛋白及信号转导通路PI3K/AKT/mTOR的影响。主要研究结果如下:1.采用水提醇沉法从银杏叶干粉中提取银杏叶粗多糖,经过脱蛋白、除色素、透析等一系列处理得到精制银杏叶多糖,苯酚-硫酸法测得多糖含量为84.66%,考马斯亮蓝法测得蛋白含量为0.561%,然后用氯磺酸-吡啶法对GBLP进行硫酸化分子修饰,氯化钡-明胶比浊法测得硫酸基取代度为2.7。2.将不同浓度的GBLP溶液与HepG2共孵育24h、48h和72h,MTT试验结果显示,随着SGBLP浓度的升高,作用时间的延长,HepG2细胞活力逐渐降低,并且呈时间-剂量依赖关系,结果表明SGBLP对HepG2增殖具有明显的抑制作用。3.采用免疫印迹技术(Western Blot)检测不同浓度的SGBLP作用HepG2细胞48h后,自噬相关蛋白LC3、p62、以及Beclin1的表达水平,凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的变化以及信号通路蛋白p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR的表达情况。试验结果显示,随着SGBLP浓度的不断增加,自噬相关蛋白Beclin1、LC3蛋白表达量升高,p62表达量降低;凋亡相关蛋白Bax表达量升高,Bcl-2表达量减少;信号通路蛋白总AKT和mTOR蛋白表达量变化不明显,而p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达量随SGBLP浓度的升高而降低。结果表明SGBLP可以诱导HepG2细胞自噬和凋亡,且PI3K-AKT-mTOR信号通路参与了该过程。4.在对HepG2细胞给予不同浓度SGBLP作用前,先用自噬抑制剂3-MA预处理HepG2细胞1h,从而抑制HepG2细胞自噬的发生。分别用MTT法检测HepG2细胞活力,以Western Blot技术检测中自噬相关蛋白LC3、p62、Beclin1以及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达量的变化。结果显示,3-MA预处理后加入SGBLP组,与单纯的SGBLP组相比,细胞活性显著降低,抗凋亡蛋白表达减少,促凋亡蛋白表达增加。这表明抑制自噬后,可以增强SGBLP对HepG2细胞的增殖活性的抑制,促进HepG2细胞的凋亡。