研究背景双胎妊娠的发生率约为1/90。有70%的双胎为双卵双胎,由两个不同的卵子分别受精而成,两个受精卵在子宫的不同部位着床,形成两个独立的胎盘和胎囊,两者血液循环不相通,两个胎囊由两层羊膜和两层绒毛膜间隔分开；而30%为单卵双胎,由单个受精卵分裂而成；根据受精卵发生分裂的时间不同而生成不同类型：在桑椹期前复制者(即受精后第3天内)为双绒毛膜双羊膜囊单卵双胎,此种类型约占单卵双胎的30%；在囊胚期复制者(受精后第4-7天内),为单绒毛膜双羊膜囊单卵双胎,此种类型约占单卵双胎的68%；在羊膜形成后胚胎才复制者(约为受精后第8天),为单绒毛膜单羊膜囊双胎,此种类型极为少见,约占单卵双胎的1～2%；而在原始胚盘形成后又复制者,则形成联体胎儿,为少见畸形。单绒毛膜(monochorionic, MC)双胎在自然受孕的妊娠中发生率约为1/250。近年来,由于生育年龄的推迟及辅助生殖技术的广泛推行,MC双胎的发生率呈现逐年增加的趋势,较自然妊娠增加约2～12倍。MC双胎围产儿发病率和死亡率均较高,如不进行积极干预,围产儿死亡率为双绒毛膜(dichorionic.DC)双胎的2倍、单胎妊娠的4倍；且存活新生儿神经系统疾病的发病率为DC双胎的4～5倍、单胎妊娠的25～30倍。单绒毛膜双胎妊娠属于极高危妊娠,可并发多种常见并发症,如：妊娠期高血压疾病(hypertensive disorders complicating pregnancy)、妊娠期胆汁淤积综合征(intrahepatic cholestasis of pregnancy, ICP)、妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)、未足月胎膜早破(preterm premature rupture of the membranes, PPROM)、前置胎盘(placenta previa)、胎盘早剥(placental abruption)等；还有一些单绒毛膜双胎特有的复杂并发症,如：双胎输血综合征(twin-to-twin transfusion syndrome, TTTs)、选择性胎儿生长受限(selective intrauterine growth restriction, sIUGR)、单绒毛膜单羊膜囊双胎(monochorionic twin)、一胎无心畸形(twin reversed arterial perfusion sequence, TRAPS)等。单绒毛膜双羊膜囊(monochorionic diamniotic, MCDA)双胎选择性宫内生长受限(selective intrauterine growth restriction, sIUGR)是单绒毛膜双胎妊娠较为常见的复杂并发症之一,其出现死胎、早产等不良妊娠结局的发生率较高,而且可能影响新生儿乃至成人后的心血管系统、内分泌代谢系统等功能,但该病的病因尚不明确,且规范化的诊断及治疗国内外同行尚未形成共识,故其成为目前复杂性双胎妊娠研究的热点问题。MCDA sIUGR的诊断标准学术界仍存在争议。目前较为广泛认可的是Gratacos等提出的标准：单绒毛膜性双胎中,任一胎儿超声检查估测体质量(或者是新生儿出生体质量)小于本地区人群参考范围相应孕周的第10百分位,即考虑诊断为单绒毛膜双胎选择性胎儿生长受限。在单绒毛膜性双胎中,如果任一胎儿体质量小于相应孕周的第10百分位,约95%以上同时会伴有两胎儿体质量的不一致(相差>25%)。MCDA sIUGR的病因复杂、未明；目前的研究主要集中在“胎盘大体”研究方面,例如：两胎儿胎盘份额差异越大,两胎儿出生体重差异随着增大；脐带异常插入可能是引起sIUGR的发病机制之一等等。这些研究都较为片面,故本研究拟从母体、胎儿及胎盘三方面系统的分析MCDA sIUGR的发生机制：首先通过回顾性分析双胎妊娠一般临床资料,并比较不同绒毛膜性质双胎合并sIUGR的母体及围产儿结局等相关数据,以寻找sIUGR的高危因素；再通过对正常单绒毛膜双胎及合并sIUGR双胎胎盘的血管铸型模型建立及相关病理研究,以探讨单绒毛膜双胎合并sIUGR发生的可能机制。血管铸型技术是以生物体血管管道为模具,借助一定外界压力将能够耐受强酸或者强碱腐蚀的灌注材料注射入生物体血管内；并待灌注材料硬化定型后,再置入强酸或者强碱中,将血管以外的组织腐蚀,仅保留血管形态；从而能够直观的反映血管的走行、直径、吻合情况、动静脉分支以及血管网络立体形态的方法。胎盘血管铸型技术是运用血管铸型技术对胎盘血管进行三维重建,使人们能够更为直观的观察到胎盘血管的形态结构。MCDA sIUGR的胎盘血管铸型可以帮助我们了解胎盘的血管吻合及分级血管管径变化等特点,以帮助我们进一步了解其发病机制。基因组印记是基因组学的一种表观遗传修饰过程,是指根据其亲本来源,沉默一个等位基因,使其单等位基因表达,即该基因只表达一方亲源的等位基因信息,而另一亲本的等位基因不表达或者很少表达的现象；而具有相应差异的基因称为印记基因(imprinting gene)。根据亲源信息的来源不同可将印迹基因分为两大类：1)母源性印迹基因：该种印记基因父系来源的等位基因信息被印迹失活,而母方来源的等位基因信息发生表达,如：H19、CDKN1、Mash-2、 ASCL2/HASH2、PHLDA2等；2)父源性印迹基因：即母系来源的等位基因信息被印迹而发生沉默,只有父方来源的等位基因发生表达,如IGF2、ZnF127、 SNRPN、Xlas、IPW、PEG3等。父源表达和母源表达的印迹基因对胚胎发育的影响是不同的；从目前发现的基因来看,父方印迹基因的作用是加速胚胎的发育；而母方则是抑制胚胎发育。IGF2(insulin-like growth factor 2)为父源性印迹基因。有研究表明:IGF2的过度表达,可能会导致胎儿宫内生长过速以及巨大胎盘的发生；而印迹缺失、表达下调将会导致胎儿宫内生长受限的发生以及胎盘小叶的萎缩。Sibley等学者发现：胎盘中IGF2的表达下调可能导致所有的胎盘小叶体积减小,改变胎盘物质交换的发展水平,IGF2表达异常与新生儿体重存在一定的相关性,即IGF2可能是人类发生胎儿宫内生长受限的原因之一。PHLDA2(pleckstrin homology-like domain fmily A member 2)印记基因(又被称为TSSC3基因、或是IPL基因),其定位于人染色体llp15.5上,是第一个被报道与“调亡”相关的印记基因。主要在胎盘中表达,其在胎盘中的表达水平与胎儿的出生体质量呈负相关。有实验显示.其在小鼠胎盘中过度表达可以抑制滋养细胞和海绵体滋养细胞的生长,如缺失可增加子代的体质量,行基因敲除的小鼠表现为胎盘,尤其是滋养细胞层过度增长。以往的研究表明IGF2及PHLDA2与胎儿宫内生长发育相关,可能是单胎胎儿宫内生长受限(intrauterine growth retardation infant, IUGR)的病因之一,但单胎IUGR和正常单胎比较主要是以胎儿体重作为分组标准,而没有排除两组间的异质性,如遗传和环境因素。我们研究MCDA双胎,比较一对双胎中两个胎儿的情况,可以将宫内环境不一致对结果的影响尽可能地降低；且单绒毛膜双胎是由同一个受精卵发育而来,理论上DNA背景几乎完全相同,故以单绒毛膜双胎为研究对象,可以将基因序列差异和环境影响因素降至最小,为比较生长受限儿和正常胎儿胎盘中印迹基因的表达水平提供理想的临床模型。本研究以单绒毛膜双羊膜囊双胎选择性胎儿生长受限产妇、胎儿、胎盘为研究对象,应用胎盘血管铸型技术对其胎盘血管构造及吻合特点进行了三维重建,并应用免疫组化的方法初步探讨了印记基因PHLDA2及IGF2在胎盘中的表达情况；同时使用ELISA的方法比较了正常单绒毛膜双胎组及合并sIUGR组胎儿脐血及产妇外周血中两组印记基因的表达差异,以期待探索单绒毛膜双羊膜囊双胎sIUGR的可能发生机制。第一章 不同绒毛膜性质双胎妊娠临床特征相关研究及选择性胎儿生长受限相关高危因素分析目的：双胎妊娠属于高危妊娠,容易发生多种产科并发症并影响围产儿结局,特别是单绒毛膜双胎妊娠,其围产儿发病率和死亡率均较高,造成的不良母婴结局更为严重。本研究通过回顾性分析不同绒毛膜性质双胎妊娠产妇的一般情况、临床并发症以及围产儿结局等情况；期待能发现单绒毛膜性双胎选择性胎儿生长受限发生的高危因素,为单绒毛膜双胎妊娠的围产期保健、并发症预防及围产儿结局改善提供一定的参考。方法：回顾性分析2013年1月至2015年6月间在南方医科大学南方医院妇产科住院分娩的460例,明确绒毛膜性及资料完整的双胎妊娠病例；根据绒毛膜性质分为单绒毛膜双胎组和双绒毛膜双胎组,对两组产妇的一般资料、并发症、围产儿结局等情况进行比较分析,并将孕妇年龄、孕产次、受孕方式、绒毛膜性、分娩孕周、分娩方式、妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病、妊娠期肝内胆汁淤积征等指标带入Logistic回归进行多因素分析,以探索sIUGR发生的相关影响因素。结果：460例双胎妊娠病例纳入研究。根据绒毛膜性质分为两组：单绒毛膜双胎组(140人,占双胎妊娠总人数的30%)及双绒毛膜双胎(320人,占双胎妊娠总人数的69.5%)组。1.两组产妇一般情况比较：产妇年龄、受孕方式、分娩方式存在显著性差异(P<0.005)；孕、产次、分娩孕周、产前住院时间、是否初产、是否合并不良孕产史方面无显著性差异(P>0.005)。2.妊娠期并发症情况比较：两组病例妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病、妊娠期胆汁淤积综合征、晚期流产、胎膜早破、早产、贫血、胎盘早剥、前置胎盘、产后出血的发生率比较无显著性差异(P>0.05)；未足月胎膜早破、选择性胎儿生长受限发生率存在显著性差异(P<0.05)。3.围产儿结局的比较：两组病例的新生儿体重(大、小)及新生儿转科率存在显著性差异(P<0.05)；新生儿身长(大、小)、新生儿窒息发生几率及胎儿畸形情况比较无显著性差异(P>0.05)。4.将选择性胎儿受限作为因变量,年龄、受孕方式、孕次、分娩孕周、妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病、绒毛膜性质、新生儿体重、身长、窒息发生率作为自变量对选择性胎儿生长受限的高危因素进行多因素Logistic回归分析,结果显示：分娩孕周及新生儿体重为危险因素。结论：1.胎盘的绒毛膜性质对孕产妇的妊娠过程及结局有着重要的影响；单绒毛膜双胎在产妇年龄、分娩方式、未足月胎膜早破及选择性胎儿生长受限发生率等方面与双绒毛膜双胎存在显著性差异(P<0.05)；2.胎盘的绒毛膜性质对妊娠过程及结局有着重要的影响,单绒毛膜性是引起s1UGR的高危因素,即选择性胎儿生长受限的主要病因来自于胎盘,应为一种“胎盘源性疾病”。3.综上所述在孕早期通过超声诊断明确双胎妊娠的绒毛膜性质可以鉴别高危妊娠,并通过超声检查密切随访,对单绒毛膜双胎妊娠加强监护、临床咨询、干预处理等方面具有重要意义。第二章 单绒毛膜双胎选择性胎儿生长受限产妇胎盘血管铸型模型的建立及其形态学研究目的：建立单绒毛膜双胎妊娠胎盘血管铸型模型,并探讨单绒毛膜双胎合并sIUGR胎盘血管形态学改变及临床意义。方法：随机选取2014年1月至2015年6月在南方医科大学南方医院妇产科住院以剖宫产方式分娩的明确绒毛膜性质、孕周相同的单绒毛膜双羊膜囊双胎产妇20例,其中合并sIUGR(A组)产妇10例,再根据新生儿出生体重的轻重,分为A1大新生儿儿组；A2小新生儿组；正常单绒毛膜双羊膜囊双胎(无合并症、并发症)(B组)产妇10例,再根据新生儿出生的先后,分为B1大新生儿组；B2小新生儿组；共20例。应用胎盘血管铸型的方法对两组产妇胎盘进行血管铸型并观测相关指标：①胎盘份额比值(大胎盘与小胎盘面积比)；②标本铸型后,计量血管吻合支情况以及胎盘各级动、静脉的血管管腔内直径等指标；③比较单绒毛膜双羊膜囊双胎合并sIUGR组(A组)与正常单绒毛膜双羊膜囊双胎组(B组)产妇胎盘血管形态学差异。结果：1.两组产妇一般情况比较：单绒毛膜双胎组：产妇平均年龄为28.36±4.79岁；平均分娩孕周为：35.10±2.69；双绒毛膜双胎组：产妇平均年龄为31.04土5.13岁；平均分娩孕周为：35.32±2.66；单绒毛膜双胎合并s1UGR产妇组(A组)两胎盘份额比值>1.5,显著高于正常单绒毛膜双胎组(B组)两胎盘份额比。10例单绒毛膜双胎合并sIUGR产妇胎盘中有6例发生脐带的异常附着(球拍状或帆状胎盘)；10例正常单绒毛膜双胎产妇胎盘中只有1例发生脐带的异常附着(球拍状胎盘)。2.单绒毛膜双胎合并sIUGR产妇(A组)两胎儿胎盘间存在丰富的血管吻合支,两胎儿各级动静脉分级血管管内直径存在显著性差异。3.正常单绒毛膜双胎组(B组)两胎儿胎盘间血管吻合情况较合并sIUGR组(A组)明显减少,两胎儿各级动静脉分级血管管内直径数值差异较小。结论：1.本项研究通过对胎盘血管的铸型,并观测及分析相关形态学改变,验证了胎盘血管吻合、胎盘份额差异以及脐带插入方式对单绒毛膜双胎胎儿生长发育的影响；即胎盘份额差异越大、胎盘血管吻合及脐带的异常插入越常见,则新生儿出生体重差异就越大；2.单绒毛膜双胎选择性胎儿生长受限产妇两胎盘血管容量、分级血管管内径、末梢动、静脉比值上存在显著性差异,这亦可能是MC sIUGR的可能病因之一；3.通过对单绒毛膜双胎胎盘血管铸型模型的建立,有助于提高对单绒毛膜双胎合并sIUGR的发病机制和临床表现的认识,对改善围产期结局也有重大意义。第三章PHLDA2、IGF-2印记基因在单绒毛膜双胎合并选择性胎儿生长受限产妇胎盘中的表达目的：本实验应用免疫组化和ELISA的方法探讨印迹基因IGF2、PHLDA2在单绒毛膜双羊膜囊双胎选择性宫内生长受限两胎儿胎盘、脐血以及产妇外周血中的表达情况,进而探讨IGF2、PHLDA2表达水平与单绒毛膜双胎sIUGR发病原因的关系。方法：随机选取2014年1月至2015年6月在南方医科大学南方医院妇产科住院以剖宫产方式分娩的明确绒毛膜性质、孕周相同的单绒毛膜双羊膜囊双胎产妇20例。1.免疫组化：A组：10例,单绒毛膜双羊膜囊双胎合并s1UGR产妇胎盘组,再根据两新生儿间体重差异分为Al(大新生儿)组,A2(小新生儿)组：B组：10例,正常单绒毛膜双羊膜囊双胎产妇胎盘组(该组病例产妇排除所有并发症及合并症),再根据新生儿出生顺序分为B1(大新生儿)组,B2(小新生儿)组。采用免疫组织化学法检测两组标本中PHLDA2和IGF2蛋白的表达情况。2.酶联免疫吸附法实验(ELISA):收集单绒毛膜双胎合并sIUGR及正常单绒毛双胎产妇外周血及两胎儿脐血标本,采用ELISA实验方法检测两组产妇外周血及两组胎儿脐血中PHLDA2和IGF2的蛋白表达差异。结果：1.两组产妇一般情况比较：单绒毛膜双胎合并sIUGR产妇组(A组)与正常单绒毛膜双胎组(B组)比较：孕妇年龄、两新生儿出生体重存在显著差异(P<0.05)。2.免疫组化结果：1)胎盘组织中IGF2染色阅片结果显示：正常单绒毛膜双胎产妇大小胎儿胎盘(B组)组织中阳性细胞颗粒较粗,在胞内弥漫性分布,可见分布于胞浆和基质。细胞呈高于背景的棕黄色或深棕黄色。单绒毛膜双胎合并sIUGR产妇大胎儿(A1)组IGF2阳性细胞数量较正常单绒毛膜双胎组稍减少,染色稍减弱；小胎儿(A2)组IGF2阳性细胞数量较正常单绒毛膜双胎组明显减少,染色明显减弱。2) PHLDA2染色阅片结果：在正常单绒毛膜双胎的两胎儿(B1、B2组)胎盘中,可见细胞无色,或者偶见淡黄色。单绒毛膜双胎合并sIUGR产妇大胎儿(A1)组PHLDA2 P刚性细胞数量较正常妊娠稍增加,染色呈淡黄色或者无色；小胎儿(A2)组PHLDA2阳性细胞数量较正常妊娠明显增多,染色明显增强,呈现棕褐色或者是棕黄色改变。3. ELISA实验结果：1)单绒毛膜双羊膜囊双胎合并sIUGR产妇两胎儿脐血间IGF2、PHLDA2表达水平存在明显差异,IGF2在小胎儿(A2)脐血中的表达水平显著低于大胎儿(A1)；而PHLDA2在小胎儿(A2)脐血中的表达水平显著高于大胎儿(A1)；两组间比较存在显著性差异(P<0.05)。2)正常单绒毛膜双羊膜囊双胎两胎儿脐血间IGF2、PHLDA2表达水平无显著性差异(P>0.05)；3)单绒毛膜双羊膜囊双胎合并sIUGR(A组)与正常单绒毛膜双羊膜囊双胎(B组)产妇血清中IGF2、PHLDA2表达水平亦存在明显差异,IGF2在合并sIUGR(A组)产妇血清中的表达水平显著低于正常单绒毛膜双羊膜囊双胎(B组)产妇；而PHLDA2浓度与正常单绒毛膜双胎组无显著性差异(P>0.05)。结论：单绒毛膜双胎合并sIUGR与正常单绒毛膜双胎产妇血清以及两胎儿胎盘、脐血中印记基因PHLDA2和IGF2的表达水平均存在差异,PHLDA2和IGF2可能通过影响胎盘生长发育和降低胎盘营养转运功能等干扰胎儿正常生长,可能是导致单绒毛膜双胎选择性宫内生长受限的致病原因之一。